骨骼肌和肌腱是人体运动系统的重要结构，特别是骨骼肌-肌腱界面（MTJ）作为结构移行处发挥着力学传递和力量调节的重要功能。据报道，全球每年新发的肌肉、肌腱相关疾病病例约为13亿例，但是治疗效果不佳。因此，构建高效准确的临床前实验模型用于肌肉、肌腱损伤的疾病机理研究以及药物研发意义重大。近年来，器官芯片技术由于其三维组织仿生程度高和能够调控培养微环境的优点成为构建高仿生体外模型的一种很有前途的方法。但是，目前关于MTJ器官芯片的研究尚未见报道。因此，如何构建具有取向性纳米纤维结构和“M型”界面结构的仿生工程化MTJ组织是研究的难点。此外，由于MTJ组织的骨骼肌端和肌腱端的细胞组成和营养需求不同，如何构建精准分区共培养系统，使MTJ组织的骨骼肌端和肌腱端分别在各自的培养基中生长也至关重要。

近日，南方医科大学王玲副教授、黄文华教授、吴耀彬副教授团队在《Small Methods》上，发表了最新研究成果“Electrospun Aligned Nanofiber Yarns Constructed Biomimetic M-Type Interface Integrated into Precise Co-Culture System as Muscle-Tendon Junction-on-a-Chip for Drug Development”。研究者基于静电纺丝技术和编织技术制备了具有仿生“M型”界面结构的工程化MTJ组织，并将其进一步集成到具有精确分区共培养系统的微流控芯片中，实现仿生MTJ器官芯片的制造，可用于骨骼肌和肌腱相关疾病的疾病机理研究和药物研发。本文的共同第一作者为南方医科大学博士研究生苏炜炜、硕士研究生杨巧、博士研究生李婷。

图1.仿生工程化肌肉-肌腱界面（MTJ）的制备及MTJ器官芯片的开发示意图

由于天然MTJ组织具有取向性纳米纤维结构和“M型”界面结构，本研究通过干湿法静电纺丝技术分别制备了取向性的骨骼肌端纳米纤维束（MNFYs）和肌腱端纳米纤维束（TNFYs），并通过编织技术将NFYs制备为具有“M型”结构的工程化MTJ支架。随后将肌卫星细胞（SCs）和肌腱干/祖细胞（TSPCs）分别接种于MTJ支架的骨骼肌端和肌腱端，并包裹一层甲基丙烯酰化明胶（GelMA）水凝胶用于抵抗外界机械、化学因素的干扰，由于MTJ支架结构的诱导，细胞在支架上取向性生长、分化，并形成工程化MTJ组织。最后，将工程化MTJ组织封装于具有分区共培养功能的微流控芯片中用于制备MTJ器官芯片，实现工程化MTJ组织的骨骼肌端和肌腱端的精准分区共培养（图1）。

图2.TSPCs在TNFYs上和SCs在MNFYs上的生长、分化研究

作者分别将TSPCs和SCs接种于MNFYs和TNFYs上，观察生长分化情况。结果表明，MNFYs和TNFYs具有良好的细胞相容性，并且MNFYs和TNFYs上的取向性纳米纤维结构能够促进细胞的取向性生长。但是，基于聚己内酯（PCL）高分子材料制备的NFYs，其表面的细胞粘附位点较少。而明胶-多巴胺聚合物（GelDA）具有丰富的RGD序列，能够为细胞提供大量的粘附位点，并促进细胞分化。因此，相较于MNFYs（GelDA-）和TNFYs（GelDA-），经过GelDA的表面包被，SCs在MNFYs（GelDA+）上、TSPCs在TNFYs（GelDA+）上的粘附能力、成肌/肌腱分化能力增强（图2）。

图3. 具有“M型”结构MTJ支架的制备与表征

天然MTJ组织具有特殊的“M型”结构，其中骨骼肌纤维和肌腱纤维相互延伸并相互交织，形成指状锥形突起。这种结构使得骨骼肌和肌腱之间的接触面积增加10到50倍，加强了它们之间的相互锚定，从而在受到较大外力时减少了撕裂或损伤的发生。并且，在人体的不同部位，骨骼肌端和肌腱端的纤维比例不同。本研究通过编织技术将MNFYs和TNFYs编织为5种不同纤维比例的、在宏观尺度上具有“M型”界面、在微观尺度上具有取向排列的纳米纤维结构的多尺度MTJ支架（图3）。

图4. SCs和TSPCs在MTJ支架上的分区接种、生长及分化研究

此外，作者分别在MTJ支架的MNFYs区域和TNFYs区域接种SCs和TSPCs细胞，观察细胞在支架上的生长、分化情况。结果表明，SCs和TSPCs在MTJ支架上呈现区域性生长分布，并形成“M型”细胞界面结构。α-actinin（红色）主要表达在MNFYs区域，SCX（绿色）主要表达在TNFYs区域。在界面处，α-actinin和SCX互相交错，形成类似“M型”结构。因此，这种多尺度MTJ支架能够诱导SCs和TSPCs细胞在MTJ支架上的取向性生长、分化并最终形成“M型”的细胞结构（图4）。

图5. 载细胞MTJ/Gel支架的制备和表征

与在培养皿中相对稳定的培养条件不同，天然MTJ组织处于复杂的微环境中，受到各种机械和生物化学因素的干扰。而GelMA水凝胶类似于天然组织的细胞外基质，可以提供多种物理化学保护作用，稳定支架的结构。本研究通过在MTJ支架表面包裹一层GelMA水凝胶制备MTJ/Gel支架。动态力学测试结果显示，MTJ支架的“M型”结构很容易受到外力的影响而被破坏，而经过GelMA水凝胶的包裹，MTJ/Gel支架的结构稳定性得到了很大程度的提升。并且，GelMA水凝胶的包裹不影响MTJ/Gel支架内TSPCs和SCs的生长和分化能力，主要是由于GelMA水凝胶呈现疏松多孔的网络结构，为培养过程中营养物质运输、代谢产物的排出以及细胞间的交流提供促进作用（图5）。

图6. 具有分区共培养功能的微流控芯片的设计与制备

MTJ组织作为一种界面组织，其细胞成分非常复杂，在组织的不同区域分布着不同的细胞类型，这些细胞对于营养成分的需求也各不相同。因此，构建分区共培养微环境，将MTJ组织的骨骼肌端和肌腱端进行分区培养以维持各自的营养需求和功能成为亟待解决的问题。本研究设计了具有分区共培养功能的微流控芯片，结果显示，SC培养基和TSPC培养基在芯片内形成培养基界面，有利于MTJ组织的分区共培养。缓冲腔室的设计能够降低培养基的流速、减少培养基中湍流的形成，有利于整个体系的稳定，并且，缓冲腔室能够有效的降低工程化MTJ组织表面的压力，有利于细胞的生长（图6）。

图7. MTJ芯片器官的有效性验证

为了验证MTJ芯片器官的有效性，作者将工程化MTJ组织放置于MTJ芯片器官进行培养，活死染色结果显示，细胞存活良好，说明灌注培养系统产生的剪切力、压力不会损伤SCs和TSPCs的细胞活性。此外，将工程化MTJ组织分别放置于器官芯片和培养皿中进行7天的培养，结果显示，工程化MTJ组织在芯片中生长良好，SCs和TSPCs分别分布在骨骼肌端纤维和肌腱端纤维，形成明显的“M型”细胞结构。但是，工程化MTJ组织在培养皿中培养时，SCs和TSPCs会向对侧迁移，“M型”细胞结构混乱不明显。表明MTJ芯片器官具有良好的分区共培养效果（图7）。

图8. MTJ器官芯片用于药物诱导的MTJ毒性和保护作用的研究

环丙沙星（CIP）是临床常用的广谱抗生素，但是能够通过氧化应激损伤，造成骨骼肌和肌腱损伤的副作用；而米托蒽醌甲磺酸盐（MitoQ）是一种线粒体抗氧化剂，能够通过抵抗氧化应激来减轻CIP的骨骼肌、肌腱损伤副作用。本研究采用CIP作为MTJ损伤的模型药物，采用MitoQ作为MTJ保护的模型药物，进行MTJ的药物毒性评估。

氧化应激荧光染色结果显示，MTJ器官芯片模型可以同时观察骨骼肌端、肌腱端以及界面处三个区域对于药物的反应，而二维细胞TCP模型只能观察散在分布的SCs和TSPCs对于药物的反应，即MTJ器官芯片能更加准确模拟体内的真实药物反应情况。并且，和二维细胞TCP模型相比，工程化MTJ组织的氧化应激水平较低，这可能是由于工程化三维MTJ组织的组织成熟度较高，抵抗药物毒性的能力较高。

此外，分化免疫荧光结果显示，MTJ器官芯片模型在肌管长度和肌腱特异性生物标志物（SCX）两方面的变化均较二维细胞TCP模型的变化显著，即MTJ器官芯片模型的灵敏度比二维细胞TCP模型高（图8）。因此，这种基于多尺度工程化三维MTJ组织构建的MTJ器官芯片更能反映体内天然组织的状态，有望为MTJ损伤的药物开发、疾病模型构建和生物学机制研究提供一个有前途的临床前实验模型。

论文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/smtd.202301754