DOI: 10.1080/10717544.2021.2021319

随着糖尿病在世界范围内的广泛流行，且考虑到糖尿病伤口微环境的复杂性，设计与开发创新型多功能伤口敷料对于治疗糖尿病患者难以愈合的伤口显得尤为重要。在本研究中，通过一种很有前途的混合静电纺丝策略制备了负载抗炎成分的纳米纤维伤口敷料，并系统地探索了其治疗糖尿病伤口的能力。将由壳聚糖（CS）和聚乙烯醇（PVA）组成的聚合物共混物电纺成CS-PVA纳米纤维垫作为对照组。同时，将不同含量的中药白头翁生物活性成分白头翁皂苷B4（ANE）负载到静电纺丝溶液中构建CS-PVA-ANE纳米纤维垫。所开发的CS-PVA-ANE伤口敷料材料具有显著的吸水性、仿生弹性力学性能、ANE缓释性能以及优异的止血性能。体外研究表明，CS-PVA-ANE纳米纤维垫可显著抑制脂多糖（LPS）刺激的促炎（M1）巨噬细胞亚群分化，减少活性氧（ROS）生成，并减少炎性细胞因子的释放。体内动物研究表明，CS-PVA-ANE纳米纤维垫通过显著提高伤口闭合率、加速良好的血管生成、促进伤口愈合各个阶段的再上皮化和胶原基质沉积来促进糖尿病伤口的愈合。本研究表明，CS-PVA-ANE纳米纤维垫通过抑制炎症活性能够有效缩短伤口愈合时间，这使其成为治疗糖尿病难愈伤口的理想候选材料。

图1.纳米纤维的物理化学结构表征。（A）不同浓度负载样品的SEM图像：样品I为纯PVA和CS；样品II至V含有不断增加的ANE浓度；（B）吸水率检测，反映为纳米纤维瞬时接触角的变化；（C）使用常规小鼠肝出血模型评估样品的止血情况；（D）经样品和对照（未处理）处理60s后受损肝脏的总失血量；（E）载有不同质量浓度ANE的样品与对照的药物释放曲线（n=5；平均值±SD）。p值：**p<0.01；N.S.（无显着差异）p>0.05。样品I：CS-PVA；样品II：CS-PVA-0.1ANE；样品III：CS-PVA-0.2ANE；样品IV：CS-PVA-0.3ANE；样品V：CS-PVA-0.4ANE。

图2.CS-PVA-ANE的相容性和抗氧化应激效率。（A）经不同纳米纤维膜处理24小时后L929细胞的细胞活力；（B）经纳米纤维膜处理24小时后L929细胞的活/死染色；（C,D）通过流式细胞术测量并量化ROS生成（n=3；平均值±SD）。p值：**p<0.01；N.S.（无显着差异）p>0.05。LPS：脂多糖；NAC：N-乙酰-L-半胱氨酸。

图3.CS-PVA-ANE的抗炎功效。（A）网络药理图；（B）经LPS和不同纳米纤维膜处理后用CD206和CD80抗体染色的巨噬细胞的流式细胞术图谱；（C,D）经ELISA测定的巨噬细胞上清液中促炎趋化因子IL-6和TNF-α的浓度。LPS：脂多糖（n=3；平均值±SD）。p值：**p<0.01。

图4.CS-PVA-ANE纳米纤维膜治疗促进糖尿病伤口愈合过程。（A）经不同治疗的小鼠伤口愈合过程的代表性图像；（B）每种治疗12天内伤口床闭合的痕迹；（n=6；平均值±SD）（C）四组不同时间点的伤口闭合率。p值：*p<0.05，**p<0.01。

图5.糖尿病伤口愈合的组织学评估。（A）第7天和第14天伤口部位的H&E染色；GT：肉芽组织；E：表皮厚度；（B）表皮厚度；（C,D）肉芽组织和毛囊厚度的量化。对照组，未治疗的糖尿病创面；CS-PVA组，用纳米纤维治疗的糖尿病创面；CS-PVA-ANE组，用ANE治疗的糖尿病伤口（n=6；平均值±SD）。p值：**p<0.01；##p<0.01；N.S.（无显着差异）p>0.05。

图6.伤口愈合后期CS-PVA-ANE加速伤口愈合的情况。（A）第14天在低、高倍率下观察的创面胶原纤维沉积；（B）Masson三色染色后胶原密度的定量；（C,D）第14天伤口床上Ki67的免疫荧光染色；（E）通过蛋白质印迹法测定的Ki67的蛋白质表达水平（n=6；平均值±SD）。p值：**p<0.01；##p<0.01。

图7.ANE调节炎症微环境以促进慢性糖尿病伤口愈合。经不同治疗后第3天采集的伤口组织，并通过ELISA测定伤口组织中趋化因子IL-6（A）和TNF-a（B）的浓度。第14天皮肤伤口组织中CD31（红色）和细胞核（蓝色）的免疫荧光图像（C）以及（D）相对覆盖区域的定量分析；（E-G）将伤口组织中的蛋白质分离出来并通过蛋白质印迹检测（n=6；平均值±SD）。p值：**p<0.01；##p<0.01；N.S.（无显着差异）p>0.05。