DOI: 10.1016/j.mtbio.2021.100179

将人工设计的分子配合物精准制备成与天然配合物相似的有序结构具有广阔的应用前景，但这仍然是该领域的一个重大挑战。在此，研究者通过基因设计含有几丁质结合域（CBD）的淀粉样蛋白，并通过将自上而下的制造过程与自下而上的自组装相结合，合理制备出含有CBD的有序功能性淀粉样蛋白-几丁质复合结构。制备方法如下：首先将含有CBD的功能性淀粉样蛋白和几丁质溶解在六氟异丙醇（HFIP）中以制造混合墨水。这种混合墨水平台，加上包括喷枪、静电纺丝和软光刻在内的多种制造方法，可产生一系列独特的自支撑结构。产品的结构特征，例如引导光路和模仿细胞外基质的能力，分别使其能够应用于功能性光栅和细胞培养。蛋白质组分的进一步基因工程使这些材料具有可调功能化特性，包括纳米粒子固定化和蛋白质缀合，从而在电子设备和酶固定中得以广泛应用。本研究所提出的技术平台为生物催化、组织工程、生物医学、光子学和电子学的发展提供了新的动力。

图1.淀粉样蛋白-几丁质混合墨水以及通过耦合不同的制造技术，将杂化油墨应用于多尺度结构制造的示意图。（a）将源自鱿鱼笔中的几丁质和源自基因工程生物膜的淀粉样纤维首先溶解在HFIP中，以获得几丁质-淀粉样蛋白混合墨水。（b）混合油墨可通过喷枪喷涂，以产生宏观尺度的薄膜结构。（c）混合油墨可以与静电纺丝工艺相结合，以产生致密的纤维网。（d）混合墨水可以与软光刻相结合以产生独立的微结构。

图2.功能性组件和混合墨水。（a）多结构域淀粉样蛋白组分的模块化基因设计：SpytagCsgACBD（SPCC）和SnooptagCsgACBD（SNCC）。（b）重组SPCC（0.5mg/ml）的原子力显微镜（AFM）图像。（c）SPCC的刚果红（CR）染色测定。（d）X射线原纤维衍射图：SPCC的（D1）和（D2）。（e）重组SNCC（0.5mg/ml）的原子力显微镜（AFM）图像。（f）SNCC的刚果红（CR）染色测定。（g）X射线原纤维衍射图：SNCC的（D1）和（D2）。（h）几丁质表面重组蛋白纤维的QCM曲线。（i）HFIP中的几丁质和淀粉样蛋白溶液。（j）几丁质和淀粉样蛋白/几丁质混合油墨在云母片上以0.5mg/ml浓度干燥的AFM地形图像。（k）几丁质和淀粉样蛋白/几丁质混合油墨在云母片上以2mg/ml浓度干燥的AFM地形图像。

图3.淀粉样蛋白-几丁质混合油墨与喷枪相结合以产生薄膜结构。（a）使用具有15度喷射角的市售工具设置混合墨水喷枪。（b）从培养皿模具中取出喷涂的透明薄膜（200s，2mg/ml）。（c）厚度约为3.5μm的喷涂薄膜的SEM图像。右侧的两张SEM图像显示了（c）中薄膜的表面形态（上图）和横截面（下图）。（d）曲线显示厚度随喷涂时间推移的趋势趋势。（e）不同厚度喷涂薄膜的透射光谱。（f）不同厚度喷涂薄膜的应力-应变曲线，以及用于计算薄膜弹性模量的拟合斜率。（g）左边的卡通图显示了spytag和spycatcher是如何相互结合的。荧光显微镜图像显示了由SPCC/几丁质薄膜结合mCherryspycatcher制成的喷涂薄膜的红色荧光。（h）左边的卡通图显示OPHspycatcher固定在由SPCC/几丁质混合墨水制成的喷涂薄膜上。右侧的曲线显示了两种不同薄膜系统（OPHspycatcher结合SPCC/几丁质薄膜以及OPHspycatcher结合CsgACBD/几丁质薄膜）的对氧磷转化率。

图4.淀粉样蛋白-几丁质混合油墨与静电纺丝相结合以产生纤维网。（a）电纺纤维网。（b）一种自支撑静电纺丝纤维网膜。（c）SEM图像显示了自支撑电纺纤维网膜的横截面和表面形态。（d）荧光显微镜图像显示了由分别与mCherryspycatcher和GFPsnoopcatcher共轭的SPCC/几丁质和SNCC/几丁质电纺纤维网制成的电纺纤维网的红色和绿色荧光。（e）示意图显示了与量子点（QD）共轭的电纺纤维（左）以及显示量子点与纤维结合的TEM图像（右）。（f）SEM图像相应元素的EDS（能量色散光谱仪）映射图像。（g）荧光显微图像显示了发红光量子点功能化电纺纤维（CdSeS@ZnS QDs）的红色荧光。（h）电纺纤维上QD阵列的CdSeS@ZnS光致发光光谱。（i）示意图显示了在电纺纤维网上生长的细胞。定量台盼蓝计数测定显示标准增殖期后HEK293T和NIH3T3的活力；测量值是一式三份培养物的平均值。（j）SEM图像显示细胞与电纺纤维网保持良好的相互作用。（k）明场和荧光叠加图像显示HEK293T细胞和NIH3T3细胞可以在电纺纤维网上正常生长。

图5.淀粉样蛋白-几丁质混合油墨结合软光刻可用于制备图案化结构。（a）基于薄膜的图案化结构的制造过程。（b）该薄膜基图案化结构的微结构图像。（c）由混合墨水制造的横杆图案。（d）由混合墨水制造的图案阵列。上图显示三角形阵列，下图显示点阵列。（e）用于引导光路的图案化结构。（f）薄膜基图案化结构和相关的光衍射图案（插图）。（g）用同样的方法制成的另一种结构。插图显示了相关的衍射图。（h）（f+g）的衍射图。（i）独立式光子器件的制造过程。（j）图案化的独立光子器件和折叠器件。（k）折叠100次后独立式光子膜的SEM图像和相关的衍射图。（l）SEM图像显示了丙酮处理前后的独立光子膜。（m）独立点和多孔膜的制造过程。（n）独立点。右上角的图像显示了一个点的放大图。（o）荧光显微镜图像显示独立复合点与由SNCC/几丁质制成的GFPsnoopcatcher结合。（p）荧光显微镜图像显示独立复合多孔膜与由SNCC/几丁质制成的GFPsnoopcatcher结合。