DOI: 10.1016/j.actbio.2021.11.030

钙化性主动脉瓣疾病（CAVD）是老年人最常见的瓣膜疾病。由于人们对CAVD的潜在机制尚不清楚，因此靶向药物治疗受到限制。适当的3D体外模型能够提高科研人员对该疾病的认识。在此，研究者开发了一个3D体外主动脉心脏瓣膜模型，该模型类似于瓣膜细胞外基质的形态，并模仿天然主动脉瓣膜纤维和海绵体的机械和生理特性。作者采用低温静电纺丝技术设计了一种双层低温静电纺丝支架（BCES），其具有明确的形态，允许瓣膜内皮细胞（VEC）粘附和瓣膜间质细胞（VIC）向内生长到支架中。使用自行设计的细胞培养插入物，通过在电纺支架的一侧接种VIC，另一侧接种VEC来同时建立瓣膜共培养。使用既定的成骨培养方案和此处设计的3D体外主动脉心脏瓣膜模型成功进行了钙化原理验证研究。

图1：不同层形态显示BCES的IL上的大孔和n-IL上的小孔。A）低温静电纺丝工艺的设置。B）带有覆盖冰晶和电纺双层支架的旋转低温滚筒。C）冻干后双层支架横截面的SEM图像。D）IL的SEM图像显示随机取向和松散堆积的纤维。E）n-IL的SEM图像显示具有自闭合膜的蜂窝结构。F）IL的纤维尺寸分布显示微米级的平均纤维尺寸。G）n-IL显示纳米级的平均纤维直径。H）IL的孔径分布显示平均孔径大于10µm。I）n-IL的孔径分布显示平均孔径小于10µm。

图2：处理对BCES的影响以及浸没对纤维和孔隙形态的影响。A-F）A）未处理的IL、B）未处理的n-IL、C）消毒的IL、D）消毒的n-IL、E）FN生物功能化IL和F）FN生物功能化n-IL的SEM图像。G）FN生物功能化IL和H）FN生物功能化n-IL的免疫荧光染色（抗FN抗体（红色））。I）暴露（浸入）于培养基的IL和J）浸入培养基的n-IL的SEM图像。图像左下角的插图显示了接触角测量值。非生物功能化支架（A-D）是疏水的，FN生物功能化（E-J）后的支架是亲水的。比例尺=100µm，插图的比例尺为5µm。

图3：IL和n-IL之间的强附着力可防止BCES在机械应力下分层。A）BCES的IL和n-IL在拉伸测试后没有分层。B）BCES的应力-应变曲线显示单个断裂点（BP），这表明两层之间有很强的附着力。

图4：松散堆积且相互连接的多孔IL使VIC通过该层渗透和迁移。A）接种1天后在BCES上培养的对照和离心VICs的活/死染色，白色箭头表示死细胞，n=3。B）对照和离心VICs的生存能力相当，双尾t检验，平均值±SD，n=3，p<0.05，n.s.=不显著。C）培养6天后测量的代表性样本BCES中浸润的VICs的z堆叠，显示纤连蛋白（红色）、F肌动蛋白（蓝色）DAPI（白色）。D）培养6天后渗透到IL中的VICs的横截面，显示为对DAPI信号的检测。VICs的向内生长深度和分布是通过使用Imaris®的点函数算法对DAPI信号进行计算来确定的。E）VICs在培养3天后达到70µm的最大向内生长深度，在培养6天后达到100µm，n=4。F）培养6天后接种在n-IL上的VECs的横截面。G）VECs粘附在n-IL上并且没有渗入BCES，n=4。

图5：BCES的生物功能化层可使VICs渗透和VECs粘附。A-B）VICs的F-肌动蛋白表达显示出拉长的成纤维细胞样形态。C-F）SEM图像显示BCES的FN生物功能化IL侧的均匀粘附。E）观察到VICs渗透到IL中（见绿色箭头）。VICs形成的丝状伪足（红色箭头）（E，F）表示VIC-VIC接触和VIC-IL相互作用。G-H）组织学分析显示VICs迁移到微纤维IL。I-J）VECs表达PECAM1并显示出典型的鹅卵石细胞形态。K-N）SEM图像显示VECs均匀粘附到BCES的n-IL上，丝状伪足的形成（见红色箭头（M，N））表明VEC-VEC接触和VEC-n-IL相互作用。O-P）组织学染色显示VEC粘附在纳米纤维n-IL上，而在培养3天和6天后未观察到VEC迁移到IL上。

图6：在BCES上共培养VICs和VECs的AHVCC模型。A-B）VICs的F-肌动蛋白表达显示出拉长的成纤维细胞样形态。C-D）PECAM1抗体染色显示典型鹅卵石形态的VECs。E-F）SEM图像显示VICs成功粘附在IL上。G-H）SEM图像突出显示n-IL上的VEC粘附。I）AHVCC横截面的H&E染色显示VICs浸润到IL中以及VEC粘附在n-IL上。J-L）AHVCC模型横截面的IF染色：J）PECAM1，K）α-SMA以及L）PECAM1和α-SMA的合并。

图7：通过蛋白质表达的荧光强度分析单一培养和AHVCC模型中VIC和VEC对BCES的反应。显示了细胞-细胞接触（A1-B3、E1-F3）、细胞-材料相互作用（A1-D3）和细胞表型特异性标记物（G1-J3）。与VEC单一培养相比，在AHVCC培养中观察到PECAM1（H1-H3）显著减少，波形蛋白表达（J1-J3）显著增加，n=3，比例尺10µm。（K1-L3）使用DAPI通过相对像素强度（RPI）评估VIC和VEC细胞数，并绘制n=6的平均值，比例尺50µm。双尾t检验，平均值±SD，p值<0.05表示存在显著性，n.s.=不显著。

图8：2D单一培养和3D共培养钙化模型的比较。使用茜素红染色在FN生物功能化A）玻璃、B）TCPS和C）BCES上的OM（成骨培养基）中培养4周的VICs（插图显示CM中的VICs），以及D）玻璃和E）BCES的SEM图像。结节的形成和茜素红染色呈阳性表明VICs被活化。F）2D玻璃和3D BCES上的VICs，用α-SMA（红色）和DAPI（蓝色）染色。G）统计分析，每组n=3。H）在CM和OM中培养4周的AHVCC模型内的VIC和VEC的SEM图像。在成骨培养条件下观察到结节（红色）。I）统计分析，每组n=3双向方差分析，*p<0.05，**p<0.005，***p<0.0005，n.s.=不显著。