DOI: 10.3390/ijms222011184

苯丙氨酸解氨酶（PAL）催化苯丙氨酸的非氧化性脱氨生成反式肉桂酸和氨。在本研究中，以葡聚糖聚醛为交联剂，在静电纺丝纳米纤维上固定重组绿竹BoPAL1/2蛋白。利用中心复合设计（CCD）-响应面法（RSM）优化静电纺丝参数。在四种酶中，表达eBoPAL2的大肠杆菌表现出最高的催化效率。经研究，制备纳米纤维的最佳条件如下：流速为0.10mL/h，电压为13.8kV，距离为13cm。响应面模型用于获得较小的纤维直径以及酶固定中的最高PAL活性。与游离BoPALs相比，固定化BoPALs可以重复使用至少6个连续循环。固定化BoPAL蛋白在4℃下储存30天后的剩余活性在75%-83%之间。此外，固定化BoPAL蛋白对变性剂的耐受性显着增强。因此，葡聚糖聚醛天然交联剂可以有效替代传统的化学交联剂用于固定BoPAL酶。所制备的PAL/尼龙6/聚乙烯醇（PVA）/壳聚糖（CS）纳米纤维极其稳定，可用于未来工业领域。

图1.BoPAL1/2催化脱氨反应将L-苯丙氨酸转化为反式肉桂酸。

图2.纯化大肠杆菌和毕赤酵母中的重组BoPAL蛋白。（A），大肠杆菌中eBoPAL1的表达和纯化；（B），大肠杆菌中eBoPAL2的表达和纯化；（C），毕赤酵母中pBoPAL1的表达和纯化；（D），毕赤酵母中pBoPAL2的表达和纯化。使用Ni NTA树脂纯化重组BoPAL蛋白，并使用10%SDS-PAGE进行分析，然后用考马斯亮蓝-G250染色。Mr，Bio-Rad精度加双色标准；CE，粗提物；SP，可溶性蛋白；UN，未结合的蛋白质。用不同浓度的咪唑缓冲液分离和洗脱Ni NTA结合蛋白。

图3.最佳交联条件。（A），重组蛋白与浓度范围从1%到5%不等的葡聚糖聚醛孵育3h，然后进行PAL活性测定。（B），重组蛋白与2%葡聚糖聚醛孵育3至24h，然后进行PAL活性测定。所有实验均进行三次，并表示为平均值±S.D.（误差线）。不同字母表示差异显着（p＜0.05）。

图4.通过响应面方法确定最佳电纺纳米纤维。（A），流速和电压对PAL活性的影响。（B），流量和距离对PAL活性的影响。（C），电压和距离对PAL活性的影响。（D），流量和电压对纳米纤维直径的影响。（E），流量和距离对纳米纤维直径的影响。（F），电压和距离对纳米纤维直径的影响。红色和蓝色分别表示高值和低值。

图5.BoPAL固定化电纺纳米纤维的表面形态。通过热场扫描电子显微镜对尼龙6/PVA/CS纳米纤维（A）和交联BoPAL2纳米纤维（B）进行监测。（C），通过傅里叶变换红外光谱对尼龙6/PVA/CS纳米纤维和交联BoPAL2纳米纤维进行分析。

图6.游离和固定化BoPAL蛋白的最适温度分析：（A）eBoPAL1，（B）eBoPAL2，（C）pBoPAL1，（D）pBoPAL2。在标准测定条件下测量游离或固定化BoPAL蛋白的PAL活性，温度范围为25-80℃。最大PAL活性标准化为100%。所有实验一式三份进行，并表示为平均值±S.D.（误差线）。

图7.游离和固定化BoPAL蛋白的最佳pH分析：（A）eBoPAL1，（B）eBoPAL2，（C）pBoPAL1，（D）pBoPAL2。在标准测定条件下测量游离或固定化BoPAL蛋白的PAL活性，pH范围为5-11。最大PAL活性标准化为100%。所有实验一式三份进行，并表示为平均值±S.D.（误差线）。

图8.电纺纳米纤维上固定化BoPAL的可回收性。在标准测定条件下测量固定化BoPAL蛋白30分钟期间的PAL活性，然后转移到另一种测定混合物中，共6次。所有实验一式三份进行，并表示为平均值±S.D.（误差线）。数据通过单向方差分析得出，不同的字母表示显著差异（p＜0.05）。

图9.游离和固定化BoPAL蛋白的储存稳定性：（A）eBoPAL1，（B）eBoPAL2，（C）pBoPAL1，（D）pBoPAL2。样品在4℃冰箱中最多可保存30天。每3天在标准测定条件下测量游离或固定化BoPAL蛋白的PAL活性。最大PAL活性标准化为100%。所有实验一式三份进行，并表示为平均值±S.D.（误差线）。

图10.电纺纳米纤维上游离和固定化BoPAL的变性剂耐受性。在标准测定条件下，当存在2%SDS、6M尿素或40%乙醇时，测量游离或固定化BoPAL蛋白的PAL活性。所有实验一式三份进行，并表示为平均值±S.D.（误差线）。数据通过单向方差分析得出，不同的字母表示显著差异（p＜0.05）。