DOI: 10.3390/nano11040995

血小板裂解物（PL）是生长因子和其他生物活性分子的天然来源，这些生物活性PL成分的局部控制释放能够促进慢性伤口的愈合。在此，研究者通过无针静电纺丝技术，以高分子量、高水解度的聚乙烯醇（PVA）为原料，掺入PL（10％w/w），制备了复合纳米纤维网。然后对所得复合PVA-PL纳米纤维垫中的纳米纤维形态、润湿性和蛋白质释放进行评估。使用HaCaT角质形成细胞、人隐性内皮细胞（HSVECs）和3T3成纤维细胞证实了PVA-PL纳米垫的体外生物活性。PVA-PL支持细胞粘附、增殖和生存。通过形成对细胞角蛋白10呈阳性的中间细丝，可以证明由于PVA-PL的存在，HaCaT细胞表型成熟度得以改善。PVA-PL通过HSVECs促进血管性血友病因子的合成，并通过8μm孔径膜增强HSVECs趋化性。上述结果表明，PVA-PL纳米垫对伤口愈合过程涉及的三种细胞类型具有良好的作用，是进一步体内实验评估的理想候选材料。

图1.静电纺丝聚乙烯醇（PVA）（A，B）和PVA-血小板裂解物（PL）（D，E）的扫描电子显微镜（SEM）图像，放大倍数×2,000（比例尺=20μm）和×5,000（比例尺=10μm）。PVA（C）和PVA-PL（F）纳米垫的纤维直径分布直方图。

图2.将纳米纤维浸入PBS后，PVA、PVA-PL、纺粘型织物、纺粘型织物上的PVA（PVAs）和纺粘型织物上的PVA-PL（PVA-PLs）在0-5s（A）和0-40s（B）时的均方根值。

图3.在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中孵育7天后，PVA-PL纳米垫的实际蛋白质浓度（A）和累积蛋白质释放（B），数据表示为平均值±标准偏差（A），均值±均值标准误差（SEM）（B）。

图4.在补充有2％胎牛血清（FS）以及0、1、2.5和5％PL的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）和补充有10％FS的DMEM中，在玻璃上培养的HaCaT细胞的活性（A）。在补充2％FS、0％和2.5％PL的DMEM中，以及在补充2％FS，添加PVA和PVA-PL纳米片的DMEM中，HaCaT细胞的活性（B）和群体密度（C）。将细胞培养1-7天（A）和1-14天（B，C）。数据以平均值±标准误差表示，＃表示p<0.001，*表示p<0.05。

图5.接种后第1天HaCaT细胞的德克萨斯红C2-马来酰亚胺染色（A-D），以及接种后第3天这些细胞中基础细胞角蛋白的免疫荧光染色（E-H）。将细胞接种在含有2％FS的DMEM中的玻璃上，其中不存在PL（A，E），存在2.5％PL（B，F），存在PVA纳米垫（C，G）和存在PVA-PL纳米垫（D，H）。用Hoechst 33258对细胞核进行复染色，通过Leica SPE共聚焦显微镜进行观察。比例尺=25，×63（A-D），比例尺=10μm，×100（E-H）。

图6.培养14天后，对HaCaT细胞的细胞角蛋白10（绿色）（A，A''，B，B''，C，C''，D，D''）和细胞角蛋白14（红色）（A'，A''，B'，B''，C'，C''，D'，D''）进行免疫荧光染色。细胞核用Hoechst 33258（蓝色）复染。细胞在含有2％FS、不含PL的DMEM（A，A'，A''）中的玻璃上生长，在含有2％FS和2.5％PL的DMEM（B，B'，B''）中的玻璃上生长，在含有2％FS和纯PVA的DMEM（C，C'，C''）中的玻璃上生长，在含有2％FS和PVA-PL的DMEM（D，D'，D''）中的玻璃上生长。Leica SPE共聚焦显微镜，×63，比例尺=25μm。

图7.在EGM-weak（EGMw）培养基，补充有1、2.5和5％PL的EGMw以及EGM-full培养基（A）中人隐性内皮细胞（HSVECs）的活性/cm2。在EGMw培养基，含5％PL的EGMw，添加了PVA和PVA-PL纳米垫的EGMw以及EGM-full培养基中HSVECs的活性/cm2（B）和种群密度/cm2（C）。将细胞培养1、3和7天（A，B）。接种后第7天，HSVECs中von Willebrand因子的荧光强度（D）。数据表示为平均值±SD，＃表示p<0.001，$表示p<0.01，*表示p<0.05。

图8.接种后第1天，用鬼笔环肽-TRITC对HSVEC细胞的F-肌动蛋白进行染色（A-D），第3天（E-H）和第7天（I-L）对von Willebrand因子（VWF）进行免疫荧光染色。将细胞接种在EGMw培养基中的玻璃上，该培养基不含PL（A，E，I），含5％PL（B，F，J），含PVA（C，G，K）和PVA-PL（D，H，L）。奥林巴斯落射荧光显微镜IX71，D71数码相机，×20，比例尺=100μm。

图9.HSVECs向EGMw培养基的迁移试验，其中EGMw补充有1、2.5和5％PL，PVA纳米纤维，PVA-PL纳米纤维，接种4h后向EGMw-full培养基迁移。数据以3个样本的平均值±标准误差表示。＃表示p<0.001，$表示p<0.01，*表示p<0.05。

图10.3T3成纤维细胞在含2％FS，0、1、2.5、5和10％PL的DMEM培养基中以及含10％FS的DMEM培养基中的活性（A）。3T3细胞在含2％FS，0％和1％PL的DMEM中，以及在含2％FS，PVA和PVA-PL纳米垫的DMEM中的活性（B）和细胞密度（C）。在接种后（A）第1、3、6和8天以及接种后第1、3和7天进行评估。数据表示为平均值±SD，＃表示p<0.001，$表示p<0.01，*表示p<0.05。

图11.在含2％FS，不含PL（A,E），含1％PL（B，F），纯PVA纳米垫（C，G）和PVA-PL纳米垫（D，H）的DMEM中培养3T3成纤维细胞，接种后第1天对纽蛋白进行免疫荧光染色（A-D），接种后第7天对I型胶原蛋白进行免疫荧光染色（E-H）。细胞核用Hoechst 33258复染。奥林巴斯IX71荧光显微镜，DP71数码相机，×20，比例尺=50μm。拍摄图像时使用相同的曝光时间。