DOI: 10.1016/j.biomaterials.2021.120746

经证实组织损伤后细胞向缺氧的过渡可以促进多个组织的血管生成和再生。为了利用这一优势，研究人员制备了多种模拟缺氧的支架材料，然而人工小直径血管移植物（SDVGs）的供氧状态还未得到深入研究。因此，本研究评估了植入大鼠腹腔动脉的电纺PCL移植物的氧气进入状态。近腔区和移植物壁的离光表面是常氧的，只有移植物壁的内部是缺氧的。鉴于移植物的不同氧气进入状态以及血管再生对SDVG植入成功的关键作用，本工作研究了用HIF-1α稳定剂二甲基草酰甘氨酸（DMOG）修饰SDVGs是否可以实现低氧模拟反应，从而改善整个移植物壁的血管再生。首先，通过静电纺丝法制备了DMOG负载PCL移植物，以支持DMOG在两周内的持续释放。体外实验表明，DMOG负载PCL垫具有显著的生物学优势，包括：促进人脐静脉内皮细胞（HUVECs）增殖、迁移和促血管生成因子的产生，并刺激M2巨噬细胞极化，进而促进巨噬细胞对HUVECs迁移和平滑肌细胞（SMCs）收缩表型的调节。这些有益作用可归因于在常氧条件下HUVECs和巨噬细胞中HIF-1α的稳定性。本研究结果表明，DMOG负载PCL移植物在腹动脉置换模型中改善了移植物的内皮化、收缩性平滑肌细胞再生和血管化，调节了移植物的炎症反应，从而促进了血管再生。

图1.植入大鼠腹动脉7天后PCL移植物氧气进入状态的原位评估。（A）手术时的代表性图像显示了植入的移植物，在移植物附近，一侧的肌肉被结扎，而另一侧的肌肉是正常的。手术后7天，腹膜注射HypoxyprobeTM-1。2小时后，取结扎肌肉（B），正常肌肉（C）和植入的PCL移植物（D），使用Hypoxyprobe-1试剂盒对其进行染色。与二级抗体孵育的切片仅作为阴性对照。（B）结扎肌肉切片显示完整且较高的低氧探针荧光信号，这表明结扎肌肉处于缺氧状态。（C）在正常肌肉切片中未检测到低氧探针荧光信号，这表明正常肌肉处于常氧状态。（D）植入的PCL移植物在第7天的代表性低氧探针染色图像，d1是O2从动脉血扩散到PCL移植物壁内侧的距离；d2是O2从周围组织扩散到PCL移植物壁外侧的距离。（E）d1和d2的氧气扩散距离。（F）定量分析低氧探针荧光面积与PCL移植壁面积之比。（G）PCL移植物壁内不同位置的氧气进入状态示意图。

图2.PCL和DMOG负载PCL血管移植物的表征。四种类型移植物的横截面（A）和内腔表面（B）的SEM图像。定量移植物的纤维直径（C）和孔径（D）。（E）四种移植物的代表性应力-应变曲线。（F）DMOG从不同移植物中的累积释放量。

图3.PCL和DMOG负载PCL垫的血液相容性评估。（A）通过阿的平染色观察在不同PCL和DMOG负载PCL垫上的血小板粘附。（B）基于阿的平染色图像计数粘附的血小板数目。（C）PCL和DMOG负载PCL垫上血小板粘附的代表性SEM图像。（D）通过人C3a酶联免疫试剂盒定量在不同PCL垫上的人C3a活化。还通过相同方法测试了用作对照的人体血液。定量PCL和DMOG负载PCL垫（n=5）的（E）凝血酶原时间（PT），（F）活化部分凝血活酶时间（APTT）和（G）凝血酶时间（TT）。（H）具有或不具有DMOG负载的PCL垫的溶血率（n=5）。

图4.PCL垫释放的DMOG对HUVECs功能的影响。（A）通过WB分析在PCL或DMOG负载PCL垫上培养3天的HUVECs的HIF-1α蛋白表达。（B）根据WB分析定量HIF-1α蛋白。（C）通过人VEGF ELISA检测在各种垫上培养3天的HUVECs的VEGF分泌。（D）通过CCK-8测试不同垫子上的HUVECs增殖。（E）用不同垫子培养的HUVECs的划痕-伤口迁移试验的代表性图像。（F）在6h和24h时对四组HUVECs迁移率的定量分析。（G）第3天，用DAF-FM探针检测不同垫子培养的HUVECs中细胞内NO生成的代表性荧光图像。（H）四组中HUVECs的DAF-FM荧光强度的相对定量。用裸PCL垫培养的HUVECs中的DAF-FM荧光强度定义为100％。（I）使用Griess反应测定试剂盒检测培养第3天由不同垫子培养的HUVECs释放到培养基中的NO量。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图5.PCL垫释放的DMOG对调节巨噬细胞行为的影响。（A）用PCL和DMOG负载PCL垫培养3天的RAW 264.7细胞中HIF-1α蛋白表达的WB分析。（B）通过WB分析（A）定量RAW 264.7细胞的HIF-1α蛋白。（C）第3天，在有无DMOG负载的PCL垫上培养的RAW 264.7细胞的促炎和抗炎基因的相对表达。（D）用于分析受由不同垫子培养RAW 264.7细胞调节的HUVECs迁移的共培养实验的示意图。（E）12h后HUVECs细胞迁移测定的代表性图像。（F）各组中HUVECs迁移的定量分析。（G）用于分析在不同垫子上培养的RAW 264.7细胞对SMCs功能蛋白标志物表达的调节作用的共培养实验的示意图。（H）通过WB分析与在不同垫子上生长3天的RAW 264.7细胞共培养的SMCs中的α-SMA和MYH蛋白表达。（I）通过WB分析定量SMCs中的α-SMA和MYH蛋白。*p<0.05，**p<0.01。

图6.植入后7天PCL和PCL-1.6D移植物的HIF-1α蛋白表达和巨噬细胞极化。（A）代表性的彩色超声图像显示了PCL和PCL-1.6D移植物的通畅性。（B）植入后7天两种类型移植物中HIF-1α蛋白表达的WB分析。（C）基于蛋白质印迹分析定量植入移植物中的HIF-1α表达。（D）移植第7天，HIF-1α免疫组织化学染色横截面的低放大率（左上图）和高放大率图像（图1、2和3）。（E）使用CD68和CD206抗体对移植物横截面进行免疫荧光染色以识别总巨噬细胞和M2巨噬细胞。（F至H）植入后1周，植入移植物的促炎基因（F），抗炎基因（G）和促再生基因（H）的相对表达。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图7.植入后1个月，评估移植物中的通畅性和炎症反应。（A）肉眼可见移植物管腔表面上的毛细血管形成。红色箭头指向毛细管。（B）使用CD31抗体和DAPI免疫荧光染色法分析移植物壁内的毛细血管形成和细胞密度。（C和D）定量分析每个区域的细胞数（C）和毛细血管数（D）。每个样品十张高倍率CD31和DAPI共染色图像，每组五个样品，以量化细胞密度和毛细血管密度。（E）立体显微镜图像显示PCL和PCL-1.6D移植物在植入1个月时无血栓和狭窄。（F）移植物中间区域横截面的H＆E染色表明，与PCL移植物相比，PCL-1.6D移植物已经形成了完整的新生内膜。（G）移植物横截面的代表性HIF-1α免疫组织化学染色图像。插图中显示了较低的放大倍率图像。（H）代表性CD68和CD206免疫荧光染色横截面。（I和J）每个视野中CD68+细胞数（I）和CD206+细胞数（J）的定量分析。每个样品十张高放大倍率CD68抗体或CD206抗体染色图像，每组五个样品，以量化CD68+细胞密度或CD206+细胞密度。

图8.植入后1个月，移植物的内皮化和SMCs再生。（A）通过SEM观察移植物在吻合部位、四分之一和中段的内皮覆盖情况。（B）使用eNOS抗体对移植物的纵向切片进行免疫荧光染色以分析内皮化。（C）基于eNOS染色的内皮覆盖率定量分析。（D）纵向切片的代表性α-SMA+抗体免疫荧光染色图像。（E）对α-SMA+ SMCs覆盖率的定量分析。（F）使用MYH+抗体对移植物的纵向切片进行免疫荧光染色以分析收缩性SMCs的覆盖率。（G）横截面的代表性MYH免疫荧光染色图像。（H）用MYH+抗体对纵切面进行免疫荧光染色以定量分析收缩性SMCs的覆盖率。（I）基于MYH+抗体免疫荧光染色法定量分析再生收缩性SMCs的面积。*p<0.05，***p<0.001。白色箭头：血流方向；L：内腔；黄色箭头：缝合部位。