DOI:10.1016/j.msec.2020.111792

本研究构建了一种具有分层亚微米-纳米结构的独特纳米金刚石基复合多孔材料，用于骨组织工程。该材料由静电纺丝氧化硅（SiOx）制备的亚微米纤维组成，经氧封端（O-SiOx），并密封涂覆有纳米金刚石（NCD）薄膜。然后用氢（H-NCD）或氧（O-NCD）封端NCD膜。将这些材料作为人成骨样Saos-2细胞粘附、生长和成骨分化的基质进行了测试。NCD涂层样品的初始粘附细胞数量和扩散面积、接种后7天的生长速率以及碱性磷酸酶（ALP）活性均明显高于未涂覆的O-SiOx样品。此外，O-NCD涂层样品细胞中的I型胶原蛋白浓度显著高于裸O-SiOx样品。观察到的差异可归因于NCD的可调润湿性，以及NCD涂层样品与裸SiOx表面（不稳定且快速侵蚀）相比更适合的表面形貌。H-NCD涂层和O-NCD涂层均促进了Saos-2细胞的相似初始粘附，但随后的细胞增殖活性要属O-NCD涂层样品更高。与H-NCD涂层样品相比，O-NCD涂层样品细胞中的β-肌动蛋白、纽蛋白、I型胶原和碱性磷酸酶（ALP）浓度、ALP活性以及钙沉积趋向更高，尽管这些差异未达到统计学显著性。O-NCD涂层样品的细胞性能提高可归因于这些样品的更高润湿性（水滴接触角小于10°），而H-NCD涂层样品则具有疏水性（接触角大于70°）。因此，可以将NCD涂覆多孔SiOx网视为骨组织工程的合适支架材料，尤其是那些具有O封端NCD涂层的支架。

图1.静电纺丝后的SiOx纤维膜（A），氢封端（H-NCD B）和氧封端（O-NCD C）后的金刚石涂层膜的代表性SEM图像。插图显示更高的放大倍率图像。

图2.CVD工艺后，SiOx纤维垫（A，B）和金刚石涂覆平面Si基板（C，D）的代表性AFM图像。扫描尺寸为10×10µm2（左）和1×1µm2（右）。

图3.多孔金刚石膜（NCD膜）和SiOx网格的拉曼光谱。

图4.初始疏水性SiOx纤维垫（A），亲水性O封端SiOx纤维垫（O-SiOx B）和CVD工艺之后的金刚石膜（C）的照片。

图5.（A）原始SiOx纳米纤维，（B）氧封端纤维垫（O-SiOx的亲水表面，接触角小于2°），（C）氢封端金刚石膜（即接触角约为73°的疏水性表面）和（D）氧封端金刚石膜（即接触角小于10°的亲水性表面）的润湿特性。（E）每种样品平均接触角值的图形说明（n=6，误差线显示标准偏差）。

图6.Saos-2细胞接种到H-NCD（A）和O-NCD（B）涂层膜、裸O-SiOx膜（C）以及显微镜盖玻片（D）上第1天的β-肌动蛋白免疫荧光染色。细胞核用DAPI复染。Leica DMi 8荧光显微镜，干燥的N-Plan 40x物镜，Chroma 39000和39002滤光片。比例尺=20µm。

图7.Saos-2细胞接种到H-NCD或O-NCD涂层膜、裸O-SiOx膜和显微镜盖玻片上第1、4和7天的细胞群体密度（A），接种到不同材料上第1天的细胞扩散面积（B），细胞周长（C）和细胞圆度（D）。对于每种类型的样品，数据表示为8-12个显微镜场的平均值±SD（A，B）和126-896个细胞的中值±IQR（C，D）。采用ANOVA（A，B）和Kruskal-Wallis单因素方差分析（B，D）进行统计学分析。统计学显著性：（p<0.05）与上述所有样品相比。

图8.Saos-2细胞接种到H-NCD（A）和O-NCD（B）涂层膜、裸O-SiOx膜（C）和显微镜盖玻片（D）上第7天的种群密度。细胞核用DAPI染色。Leica DMi 8荧光显微镜，物镜5x/0.12，比例尺=200µm。

图9.Saos-2细胞接种到H-NCD（A1-A3）和O-NCD（B1-B3）涂层膜、裸O-SiOx膜（C1-C3）和显微镜盖玻片（D1-D3）上第4天的纽蛋白和F-肌动蛋白染色。A1-D1：通过免疫荧光染色的纽蛋白，A2-D2：用TRITC-鬼笔环肽染色的F-肌动蛋白，A3-D3：两种图像的合并。Carl Zeiss LSM 880 NL共聚焦显微镜（德国），比例尺=20µm。

图10.Saos-2细胞接种到H-NCD（A1-A3）和O-NCD（B1-B3）涂层膜、纯O-SiOx膜（C1-C3）和显微镜盖玻片（D1-D3）上第7天的骨钙素和F-肌动蛋白染色。A1-D1：通过免疫荧光染色的骨钙素，A2-D2：用TRITC-鬼笔环肽染色的F-肌动蛋白，A3-D3：两种图像的合并。Leica DMi 8荧光显微镜，10x/0.25物镜，Chroma 39000、39002和39004滤光片。比例尺=100µm。

图11.Saos-2细胞接种到H-NCD和O-NCD涂层膜、裸O-SiOx膜和显微镜盖玻片上第7天的β-肌动蛋白（A）和纽蛋白（B）浓度。由ELISA进行测定。吸光度以对照玻璃上数值的百分比形式给出。3至7次独立测量的均值+S.E.M.。单向方差分析和Student-Newman-Keuls方法。

图12.Saos-2细胞接种到H-NCD和O-NCD涂层膜、裸O-SiOx膜和显微镜盖玻片上第7天的I型胶原蛋白（A）和ALP（B）浓度，ALP活性（C）和骨钙素浓度（D）。A，B，D：通过ELISA测量。吸光度以对照玻璃上数值的百分比形式给出。C：PNP是对硝基苯基磷酸酯水解的产物。3至7次独立测量的均值+S.E.M.。单向方差分析和Student-Newman-Keuls方法。统计学显著性：（p<0.05）与上述所有样品相比。

图13.接种后第14天和第21天，生长在O-NCD或H-NCD涂层膜、裸O-SiOx膜以及显微镜盖玻片上的Saos-2细胞的钙沉积。单向方差分析和Student-Newman-Keuls方法。3至8次独立测量的平均值±标准偏差。

图14.天然SiOx和NCD涂覆SiOx网格的应力-应变曲线。