DOI:10.1016/j.apmt.2020.100888

种植体相关感染（IRIs）和种植体骨整合障碍是全关节置换术（TJA）后最常见的灾难性并发症。巨噬细胞在这些并发症的发生中起着至关重要的作用。在此，针对IRIs和种植体骨整合障碍的免疫学特征，研究者提出了一种序贯免疫调节策略来应对该类并发症，使用由简便的静电纺丝工艺和热压法合成的Cu-Zn双层纳米纤维膜。结果表明，Cu-Zn双层纳米纤维膜具有良好的Cu2+和Zn2+的受控释放，并且可以通过交替激活MAPK和mTOR信号通路依次调节从M1到M2的巨噬细胞表型转变。此外，双时态双向免疫调节作用赋予了Cu-Zn双层纳米纤维膜在体外和体内优异的抗感染和成骨能力。这是第一种专门针对IRIs和种植体骨整合障碍的免疫要求而设计的双时态双向免疫调节生物材料。本研究工作是一次有意义的尝试，为探索新型免疫调节生物材料以解决临床挑战开辟了新的途径。

图1.Cu-Zn双层纳米纤维膜的形态表征、元素分布和离子释放行为。（a）0，（b）Zn，（c）Cu和（d）Cu-Zn双层纳米纤维膜上层和下层的扫描电子显微镜（SEM）图像。在EDS映射分析条件下的SEM图像以及Cu-Zn双层纳米纤维膜（e）上层和（f）下层的相应EDS映射结果。每隔24小时，Tris-HCl缓冲液中（g）0，（h）Zn，（i）Cu，（j）Cu-Zn双层纳米纤维膜释放的Cu2+和Zn2+浓度。注：0：含明胶膜（Gel）和PCL膜（PCL）的双层纳米纤维膜；Zn：含Gel和锌黄长石负载PCL膜（ZnPCL）的双层纳米纤维膜；Cu：含铜硅钙石负载明胶膜（CuGel）和PCL的双层铜纤维膜；Cu-Zn：含CuGel和ZnPCL的双层纳米纤维膜。

图2.不同双层纳米纤维膜对RAW264.7巨噬细胞的免疫调节作用。（a）在不同5天和11天样品的提取物中培养的RAW264.7的免疫荧光染色：绿色（iNOS，M1巨噬细胞标记物），红色（Arg-1，M2巨噬细胞标记），蓝色（DAPI）。（b）通过流式细胞仪分析的RAW264.7表面标记物CCR7（M1巨噬细胞标记物）和CD206（M2巨噬细胞标记物）的代表性散点图。（c，d）通过流式细胞仪检测到的CCR7和CD206阳性RAW264.7巨噬细胞的定量结果。（e，f）CCR7和CD206的RT-PCR分析结果。注：与0组相比，**P<0.05，***P<0.01和***P<0.001；与Zn组相比，#P<0.05，##P<0.01和###P<0.001；与Cu组相比，＆P<0.05，&&P<0.01和&&&P<0.001。

图3.Cu-Zn双层纳米纤维膜对RAW264.7巨噬细胞免疫调节机制的蛋白质组学分析。（a，c）分别对5天和11天的Cu-Zn双层纳米纤维膜的蛋白质组学结果进行火山图分析。在iTRAQ量化项目中，总共鉴定出40,511个肽和6533个蛋白质，错误发现率（FDR）为1％。选择折叠变化＞1.2且Q值＜0.05作为差异表达的显著阈值。红色和绿色点分别代表显著上调和下调的蛋白质，而黑色点代表无显著差异表达的蛋白质（DEPs）。（b，d）在（b）5天和（d）11天的比较组中，DEPs的KEGG途径富集统计数据。显示排名前10的路径术语。缩写：AD：阿尔茨海默病；OP：氧化磷酸化；RES：逆行内源性大麻素信号；MA：矿物质吸收；NAFLD：非酒精性脂肪肝；MP：代谢途径；PD：帕金森病；Ri：核糖体；Ph：吞噬体；TDM：I型糖尿病；PGI：戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互转化；En：内吞作用；ALS：肌萎缩性侧索硬化；NA：尼古丁成瘾；PM：苯丙氨酸代谢；PEI：致病性大肠杆菌感染；α-LAM：α-亚麻酸代谢；PM：丙酮酸代谢；Al：酒精中毒。（e）由Cu-Zn双层纳米纤维膜引起的巨噬细胞表型转换的可能机制示意图。

图4.使用IVIS系统测量体内不同双层纳米纤维膜的抗菌性能。（a）第0、1、4、7、10和13天小鼠背部的代表性生物发光伪彩色照片。颜色条显示细菌性PI的强度（p/s/cm2/sr）。（b）各组小鼠背部细菌性PI的时程。注：与Cu-Zn组相比，P<0.05，P<0.01和P<0.001；与Cu组相比，#P<0.05，##P<0.01和###P<0.001；与0组相比，＆P<0.05，&&P<0.01和&&&P<0.001。

图5.体内不同双层纳米纤维膜抗菌作用的系统评价。（a）术后第14天对种植体周围软组织的一般观察和组织学评估。蓝色箭头标记种植体周围软组织中的脓液和坏死组织；红色荧光指示相应的免疫荧光染色切片中渗入的中性粒细胞；红色箭头指示相应的吉姆萨染色部分中的细菌残留。（b）在体内的四个种植体上生物膜形成的一般观察和SEM结果。蓝色箭头标记种植体上已形成的生物膜和细菌。（c）第14天，对种植体中细菌负担的定量分析结果。（d）手术后第5天和第11天，对四组种植体周围软组织的组织切片进行免疫荧光染色。绿色（iNOS，M1巨噬细胞标记物），红色（CD206，M2巨噬细胞标记物）和蓝色（DAPI）。注：与0组相比，*P<0.05和***P*0.001；与Zn组相比，###P<0.001；与Cu组相比，&&&P<0.001。

图6.不同双层膜直接抗菌机制的研究。（a）定性和定量分析水溶液中不同膜产生的ROS的水平。（b）细菌形态的SEM结果。红色箭头表示细菌含受损的细胞壁或膜。（c）两种菌株生物膜结构的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）结果。生物膜中的死菌被染成红色，而活菌被染成绿色。（d，e）两种菌株生物膜中eDNA水平的定性和定量分析。注：与0组相比，***P<0.001；与Zn组相比，###P<0.001。

图7.系统评估巨噬细胞介导不同组对金黄色葡萄球菌的抗菌作用。（a）通过Operetta CLS检测到的用不同双层纳米纤维膜处理的RAW264.7巨噬细胞抗菌作用的CLSM结果。绿色（RAW264.7-GFP），红色（金黄色葡萄球菌“ST1792-mCherry”）和蓝色（Hoechst 33,342）。（b，c）不同样品条件的巨噬细胞的杀菌能力的定性和定量结果。（d，e）不同样品条件的巨噬细胞吞噬作用的定性和定量结果。注：与0组相比，*P<0.05和***P*0.001；与Zn组，#P<0.05，##P<0.01和###P<0.001；与Cu组相比，＆P<0.05和&&P<0.01。

图8.在5天和11天巨噬细胞条件培养基中体外培养14天的rBMSCs的成骨分化评估。（a）rBMSCs的碱性磷酸酶（ALP）染色。（b，c）rBMSCs中ALP和骨钙蛋白（OCN）的基因表达分析。（d）rBMSCs的OCN免疫荧光染色。绿色（OCN），红色（肌动蛋白）和蓝色（DAPI）。注：与0组相比，**P<0.05，***P<0.01和***P<0.001；与Zn组相比，##P<0.01和###P<0.00；与Cu组相比，＆P<0.05和&&P<0.01。

图9.大鼠种植体相关骨修复模型的成骨评估。（a）放射成像的经轴、矢状、冠状和3D重建Micro-CT图像。红线和蓝线指示相应的冠状截面图像的切割平面，黄色箭头标记种植体周围的新骨。（b-e）Micro-CT数据的定量分析：骨体积/总体积（BV/TV），小梁厚度（Tb.Th），小梁数目（Tb.N）和松质骨密度（BMD）。（f）未脱钙切片的茜素红S（红色），钙黄绿素（绿色）和Van Gieson（VG）染色。注：白色菱形表示种植体，白色箭头标记组织-种植体的界面。与0组相比，*P<0.05和**P<0.01；与Zn组相比，#P<0.05和##P<0.01；与Cu组相比，＆P<0.05和&&P<0.01。