DOI:10.3390/pr8111341

由创伤、癌症治疗或感染引起的骨损伤是一项重大且日益严重的全球性挑战。人口老龄化这一社会现象在其中起着关键作用，因为越来越多的骨折是由于骨质疏松症等疾病引起的，而这类疾病也给医疗保健系统带来了沉重的负担。当前的修复策略没有充分考虑健康组织中发现的细胞-底物相互作用，因此，需要更复杂的模型来对其进行完善。体外3D微环境的创建是一种新兴的以地形为导向的方法，它提供了将细胞迁移和分化机制的知识应用于创建新细胞底物的机会。此外，在体外骨再生模型中引入生物功能剂在一定程度上控制了细胞走向成骨途径的命运。在这项研究中，应用了三种方法来对空间受限的电纺人工微环境进行功能化，这些微环境呈现出天然骨干细胞巢的相关成分。在细胞外基质（ECM）蛋白（I型胶原蛋白）、糖胺聚糖（肝素）和陶瓷基材料（生物玻璃）功能化的电纺微加工支架上研究了间充质干细胞（MSCs）的生物学和成骨行为。在不改变聚己内酯（PCL）支架提供的纤维结构的前提下，成功地将胶原蛋白、肝素和生物玻璃（BG）纳入模型中。间充质干细胞（MSCs）成功植入所有生物功能支架中，当暴露于PCL/BG复合材料中时，碱性磷酸酶生成量增加。这项研究证明了制备智能化分层人工微环境以研究干细胞行为的可行性，并最终证明了将这些人工微环境整合到多功能膜中以进行骨组织再生的潜力。

图1.干细胞微环境的总体视图，显示了关键特征，细胞类型位置，并突出显示了（绿色）在这项工作中要研究的特定组件（物理和离散空间的制备以及细胞外基质（ECM））和矿物质成分（生物玻璃，BG）的生物功能化）。

图2.示意图突出显示了形貌可控电纺基材的制备方法，并总结了用于修饰电纺微环境膜的生物功能化策略。

图3.静电纺丝支架的扫描电子显微照片：（a）聚己内酯（PCL）电纺网和裸样的扫描电子显微镜（SEM）；（b）PCL电纺微环境样品的SEM显示出完整的生态位结构，其周围为平坦区域；（c）PCL电纺纤维随机分布在普通支架中；（d）扫描电镜照片显示了生态位结构内纤维分布的不同模式；（e）BG粉末的SEM显微照片，显示在同一样品中研磨后的BG颗粒具有不规则的粗糙表面和可变的粒径；（f）带有BG的电纺裸样，箭头指示BG颗粒出现在随机取向纤维结构内；（g）带有BG的电纺微环境样品，圆圈显示微环境的边缘；（h）带有BG的PCL电纺微环境样品的高倍放大，箭头指示BG颗粒出现在定向纤维结构内。

图4.电纺支架纤维的SEM分析及其排列对细胞形态的影响：（a）静电纺丝支架中合成生态位的SEM显微照片；（b-d）SEM图像显示了微环境内不同的纤维截面，具体是：（b）微环境外的随机取向纤维区域；（c）微环境壁中的定向纤维；（d）微环境底部的随机取向纤维区域；（e）以直方图的形式分析微环境不同部分内的纤维排列；（f）在更多随机纤维上生长的rMSCs的形态；（g）在更多定向纤维上生长的rMSCs的形态。

图5.PCL/BG裸样的SEM显微照片，显示了BG浓度对纤维形态和直径测量的影响：（a）PCL/0％BG；（b）PCL/10％BG；（c）PCL/30％BG；使用显示尺寸分布的直方图分析静电纺丝支架的纤维直径；柱状图显示BG浓度对PCL/BG溶液平均粘度的影响；（f）条形图显示BG浓度对纤维直径的影响。

图6.将胶原蛋白沉积到静电纺丝支架上，并用MSCs培养14天：（a）表面沉积有胶原蛋白的裸样的SEM图像。使用Photoshop将胶原蛋白标为蓝色；（b）沉积在电纺支架微环境中的胶原的SEM图像。胶原蛋白为蓝色；（c）对照支架的天狼星红染色和胶原沉积支架的红色染色，表明存在胶原；（d）基于在有无微环境和胶原蛋白的静电纺丝支架上对rMSC细胞进行14天的培养，由PrestoBlue®分析得出的细胞代谢数据。在任何条件下，使用方差分析均未发现统计学差异；（e）在无胶原蛋白的普通支架上对rMSC细胞进行14天的培养，其细胞核DAPI染色的荧光图像（蓝色）；在含胶原蛋白（伪粉色）的普通支架上对rMSC细胞进行14天的培养，其细胞核DAPI染色的荧光图像（蓝色）。

图7.将肝素沉积到电纺支架上，并用rMSCs培养14天：（a）表面沉积有肝素的普通支架的SEM图像；（b）肝素沉积到微环境中的SEM图像；（c）荧光肝素（绿色）沉积在无微环境的电纺支架上的荧光图像；（d）荧光肝素（绿色）沉积到含微环境的电纺支架上的荧光图像；（e）普通肝素涂覆支架和对照的甲苯胺蓝染色；（f）基于在有无微环境和肝素的电纺支架上对rMSC细胞进行14天的培养，由PrestoBlue®分析得出的细胞代谢数据。在任何条件下，使用方差分析均未发现统计学差异，数值为平均值±SD（N=1，n=3）；（g）在无肝素的普通支架上对rMSC细胞进行14天的培养，其细胞核DAPI染色的荧光图像（蓝色）；（h）在普通支架上对rMSC细胞进行14天的培养，其细胞核DAPI染色（蓝色）和肝素荧光（绿色）的荧光图像。

图8.BG功能化支架上的细胞形态和分布：（a）含10％BG的普通样品的细胞核DAPI染色（蓝色）的荧光显微镜图像；（b）含10％BG的微环境样品的细胞核DAPI染色（蓝色）的荧光显微镜图像；（c）30％BG普通样品的SEM显微照片；（d）含10％BG的微环境样品的SEM显微照片；（e）10％BG微环境的共聚焦显微镜图像；（f）30％BG微环境底部的共聚焦显微镜图像；（g）10％BG普通样品的共聚焦显微镜图像；（h）微环境结构的共聚焦显微镜热图，每种颜色表示细胞穿透的特定深度。据观察，细胞在微环境的中心（红色区域）穿透了180µm的深度，而在微环境的边缘它们表现出表面膨胀（蓝色区域）。

图9.BG功能化支架的生物学评估。ALP分析图片：（a）裸样0％BG；（b）微环境样品0％BG；（c）裸样10％BG；（d）微环境样品10％BG；（e）裸样30％BG；（f）微环境样品30％BG；（g）通过计算光学图像中污渍覆盖率而获得的微环境样品的ALP定量；（h）基于比较实验第1天和第14天之间膜设计和组成的影响，由PrestoBlue®分析得出的细胞代谢数据。