DOI: 10.1002/jcp.30095

聚偏二氟乙烯（PVDF）具有良好的生物相容性、压电特性以及易于制备等优点，被广泛应用于包括干细胞工程在内的许多生物医学领域。然而，人类胚胎干细胞（hESCs）的长期培养及其在PVDF上向心肌谱系分化的研究尚未见报道。在本文中，通过静电纺丝法制备了PVDF纳米级膜支架。将玻连蛋白衍生肽-贻贝粘附蛋白融合物（VNm）固定在支架上。在VNm涂覆PVDF支架（VNm-PVDF支架）上培养的hESCs可稳定扩增10代以上，同时保持多潜能标记物的表达和基因组的完整性。在心肌分化条件下，与仅在基质胶和VNm上培养的基因相比，在VNm-PVDF支架上的hESCs产生了更多自发跳动的菌落，并显示出心肌相关基因的上调。因此，VNm-PVDF支架适用于hESCs的长期培养及其向心肌细胞的分化，从而扩大了该支架在再生医学中的应用。

图1.聚偏二氟乙烯（PVDF）纳米支架的表征。（a，b）PVDF膜中纤维的代表性扫描电子显微镜图像，比例尺=10µm。（c）PVDF纤维直径的分布。

图2.hESCs在不同基质和VNm-PVDF支架上的附着和生长。（a-d）AP染色的低倍率代表性图像。（e-h）AP阳性染色菌落的代表性高倍图像。（i-l）在不同基质上生长的菌落的明场图像。请注意，菌落由虚线勾画出，因为在相衬显微镜下看不到VNm-PVDF支架上的细胞。比例尺=200µm。AP，碱性磷酸酶；hESC，人类胚胎干细胞；PVDF，聚偏二氟乙烯；VNm，玻连蛋白衍生肽-贻贝粘附蛋白融合物。

图3.在VNm-PVDF支架上长期培养hESCs的多能性标记物表达和扩增的稳定维持。（a）10代后，AP和多能性标记基因（OCT4和SOX2）表达明显，比例尺=200µm。（b）hESCs在VNm-PVDF支架上的增殖速率与在传统基质上增殖10代以上的细胞相当。2D，二维；AP，碱性磷酸酶；DAPI，4ʹ，6-二氨基-2-苯基吲哚；hESC，人类胚胎干细胞；PVDF，聚偏二氟乙烯；VNm，玻连蛋白衍生肽-贻贝粘附蛋白融合物。

图4.长时间培养后，在VNm-PVDF支架上生长的hESCs中多能性标记基因的高表达。（a）多能性标记基因在不同基质上表达的FACS分析。（b）定量基因表达分析显示，在VNm-PVDF支架上的hESCs中，多能性基因的表达与在基质胶上的表达相当。2D，二维；FACS，荧光激活细胞分类；hESC，人类胚胎干细胞；mRNA，信使RNA；ns，不显著；PVDF，聚偏二氟乙烯；VNm，玻连蛋白衍生肽-贻贝粘附蛋白融合物。

图5.hESCs在具有不同厚度和纤维直径的VNm-PVDF支架上的生长情况。（a）在不同VNm-PVDF支架上生长的hESCs的形态和AP免疫反应性。比例尺=100µm。（b）hESCs在不同VNm-PVDF支架上生长10代的正常核型。2D，二维；AP，碱性磷酸酶；hESC，人类胚胎干细胞；PVDF，聚偏二氟乙烯；VNm，玻连蛋白衍生肽-贻贝粘附蛋白融合物。

图6.hESCs在VNm-PVDF支架上的心肌分化增强。（a）在心肌分化条件下培养的hESCs菌落的形态。比例尺=100µm。（b）不同基质上自发跳动菌落的定量；*p<.05；**p<0.01。Kruskal-Wallis单向方差分析，对于MG以及A型和B型组，n=6；对于VNm组，n=3。（c）心脏标记基因的定量基因表达分析；*p<.05，**p<.01。Kruskal-Wallis单向方差分析，对于MG以及A型和B型组，n=6；对于VNm组，n=3。（d）在B型支架上自发跳动的菌落中细胞的超微结构。“z”表示肌节样结构中的z盘，白色箭头表示间隙连接。ACTN2，肌动蛋白α2；ANOVA，方差分析；ES，胚胎干细胞；GATA4，GATA结合蛋白4；hESC，人类胚胎干细胞；MG，基质胶；MYOD，成肌分化1；ns，不显著；PVDF，聚偏二氟乙烯；TNNT2：肌钙蛋白T2，心肌型；TTN：肌联蛋白；VNm，玻连蛋白衍生肽-贻贝粘附蛋白融合物。