DOI: 10.1039/D0BM01325K

伤口愈合是一个重要的临床问题，研究人员正在不断探索如何促使伤口尽早愈合并提高其恢复能力。虽然伤口愈合的病因是多因素的，但是高度炎症和增加的氧化应激会导致慢性炎症、内皮功能障碍和胶原蛋白降解，从而延缓了整个愈合过程。因此，对氧化应激的可视传感在成功实施基于特定要求的伤口愈合疗法方面是非常有用的。在这项研究中，采用静电纺丝法制备了丝素蛋白纳米纤维垫，并注入了能够检测到过氧化氢（一种活性氧分子）的Amplex Red。当H2O2浓度为1μM时，这些垫子在检测限下产生了可见的颜色变化。在有受损伤口的糖尿病小鼠中进行的体内研究显示，在24小时内注入Amplex Red的垫子的颜色发生了明显变化。这些注入Amplex的电纺丝素蛋白纳米纤维垫具有增强伤口愈合疗法的潜力。

图1：在过氧化物酶和H2O2存在下，Amplex Red氧化为可见颜色产物的示意图。在过氧化物酶存在下，Amplex Red试剂与H2O2的相互作用导致其氧化成可见的粉红色化合物Resorufin。在此，该反应在含有Amplex Red和过氧化物酶相互作用的小瓶保持无色的状态下进行。但是，添加的H2O2会导致Amplex Red瞬间氧化成高度可见的粉红色Resorufin化合物。

图2：通过脱胶过程和增溶作用，从生丝茧中制备丝素蛋白的示意图。丝素蛋白溶液的静电纺丝可形成纳米纤维丝素蛋白垫。

图3：使用扫描电子显微镜（SEM）对含有和不含有复合物的电纺丝素蛋白纳米纤维垫进行了表征。SEM分析表明连续的丝素蛋白纳米纤维的形成导致电纺丝素蛋白垫的合成。A）代表纳米纤维丝素蛋白垫，而B）代表注入Amplex Red的纳米纤维丝素蛋白垫。在这两种丝素蛋白垫中均可以观察到超细连续纳米纤维的形成。C）显示了使用ImageJ分析每个样品中10种不同纳米纤维的纳米纤维尺寸测量的条形图（来自SEM图像）。添加Amplex Red对纳米纤维的直径没有任何显著影响。D）还对丝素蛋白垫和注入Amplex Red的丝素蛋白垫进行了FTIR分析。酰胺区域峰的存在范围为1600 cm-1、1500 cm-1和1200 cm-1，表明存在丝素蛋白的无规卷曲和β-折叠构象以及纳米纤维的水稳定性。在2900 cm-1、2800 cm-1、1000 cm-1和950 cm-1区域还存在其他特定峰，表明Amplex Red化合物已注入纳米纤维丝素蛋白垫中。（R）代表丝素蛋白的无规卷曲构象，而（B）代表丝素蛋白的β-折叠构象带。

图4：正在测试注入Amplex Red化合物的丝素蛋白纳米纤维垫，作为视觉检测H2O2的概念证明。A）代表对照（丝素蛋白垫）和注入Amplex的丝素蛋白垫（厚垫的厚度约0.0043mm，薄垫的厚度约0.001mm）。厚和薄纳米纤维丝素蛋白垫可通过将Amplex Red氧化为Resorufin而有效地显示出粉红色。B）代表用于进一步传感测量的电纺丝素蛋白垫的尺寸。这些尺寸为1x0.5cm（长x高），用于传感测量。C）用2种不同浓度的H2O2和HRP处理注入Amplex的丝素蛋白垫，其浓度相差100倍。左上角显示了一个对照垫，用于进行颜色对比。经过氧化氢处理后，垫子可以有效地显示可见的颜色。D）对照丝素蛋白垫、注入Amplex的丝素蛋白垫和注入Amplex的丝素蛋白垫的表面元素分析，其通过Amplex Red成分的氧化而发生颜色变化。全扫描光谱（i）丝素蛋白垫，（ii）注入Amplex的丝素蛋白垫：未氧化，以及（iii）注入Amplex的丝素蛋白垫：氧化。各丝素蛋白垫的C 1s光谱以及实验光谱的反褶积，其峰对应于C-C/C=C、C-N、C-O和C=O的结合能。给出了拟合光谱和实际光谱。

图5：使用人皮肤角质形成细胞（HaCat），通过MTT分析测定细胞活性，对Amplex Red化合物进行细胞生物相容性分析。细胞活性超过80％被认为具有生物相容性。使用不同浓度的Amplex Red化合物，当进行A）24小时和B）48小时细胞生物相容性测试时，浓度高达388 µM具有高度生物相容性。

图6：用固定浓度的HRP和浓度范围为1 mM至1μM的不同浓度的H2O2处理的对照和注入Amplex的丝素蛋白垫，通过ImageJ软件对颜色强度的变化进行量化，找到丝素纤维蛋白垫的检测限值。A）在30分钟、24小时和48小时的时间点，在25μg/mL的固定HRP浓度和不同H2O2浓度下的对照组和注入Amplex的丝素纤维蛋白垫。B）在30分钟、24小时和48小时的时间点，在0.25μg/mL的固定HRP浓度和不同H2O2浓度下的对照组和注入Amplex的丝素纤维蛋白垫。C）在24小时的时间点对用0.25μg/mL HRP处理过的垫子的颜色强度进行定量。D）在48小时的时间点对用0.25μg/mL HRP处理过的垫子的颜色强度进行定量。

图7：使用糖尿病（Db/Db）伤口愈合的糖尿病小鼠模型，用注入Amplex的丝素蛋白垫进行H2O2颜色传感。在这些体内研究中，使用了对照丝素蛋白垫、H2O2颜色传感丝素蛋白垫（厚度约0.001mm）和H2O2颜色传感丝素蛋白垫（厚度约为0.0043mm），即使用了注入Amplex的丝素蛋白垫。在糖尿病小鼠的皮肤上产生8毫米的皮肤伤口，适当地使用这些垫。观察后发现，在24小时内，由于受到过氧化氢氧化分子和从伤口处渗出的过氧化物酶的影响，过氧化氢颜色传感丝素蛋白垫的白色变为粉红色，这表明24小时内浓度较高。