DOI: 10.1021/acsbiomaterials.0c00893

与生精小管最具相似性的3D基底的工程设计将有助于由干细胞体外生产功能性精子细胞。在此，作者介绍了一种接种有支持细胞的3D电纺明胶（EG）基底，并测定了其指导胚胎干细胞（ESCs）向生殖细胞分化的潜力。采用静电纺丝法制备了EG，通过MTT法和细胞贴壁试验证实了其在SEM下的形态以及对支持细胞和ESCs的细胞生物相容性。由胚胎干细胞形成胚状体（EBs），与支持细胞共培养，并用BMP4连续诱导3天和7天，使EBs向生殖细胞分化。通过免疫细胞化学（ICC）、流式细胞术和RT-PCR研究了四个实验组中EB（在明胶涂覆细胞培养板上培养EBs），支架/EB（在EG上培养EBs），ESCs/Ser（在没有EG的明胶涂覆细胞培养板上共培养EBs和支持细胞），以及支架/EB/Ser（在EG上共培养EB和支持细胞）的分化情况。与EB组相比，所有实验组的MVH（生殖细胞特异性标志物）表达均显著增加，而c-KIT（干细胞标志物）表达则降低。ICC和流式细胞仪检测显示，与其他组相比，支架/EB/Ser在分化后3天和7天具有最高的MVH水平和最低的c-KIT表达。RT-PCR结果显示，与EB组相比，支架/EB中的生殖细胞标志物（Dazl）显著增加，而ESCs干细胞标志物（Nanog）显著降低。与支架/EB组相比，支架/EB/Ser中的生殖细胞标志物Gcna、Stella、Mvh、Stra8、Piwil2和Dazl显著增加。该研究结果显示，EG支架可以提供一个与天然生精小管微/纳米结构极具相似性的良好基质，并为支持细胞与EBs通信提供了平台，以使ESCs生长和分化为生殖细胞。

图1.研究设计的示意图。简而言之，通过静电纺丝技术制备了电纺明胶垫，并接种了从小鼠睾丸中分离的支持细胞和C57Bl/6小鼠ESCs衍生的EBs。用BMP4处理细胞以诱导生殖细胞谱系分化。通过使用流式细胞仪/免疫组织化学和实时PCR评估生殖细胞和ESCs特异性标志物来测定分化。

图2.（a）与戊二醛交联前后的电纺明胶（EG）的SEM显微照片。（b）在光学显微镜下观察支持细胞和胚胎干细胞（ESCs）的培养。（c）在扫描电镜下观察EG垫上的支持细胞、ESCs以及共培养的支持细胞和ESCs。（d）在EG上培养1、3和7天后细胞的细胞活性。实验组之间的比较：ESCs-EG组与ESCs-GP组比较；ESC/Ser-EG组与ESC/Ser-GP组比较。

图3.在四个实验组中，在诱导分化的第3天（a）和第7天（b）进行c-KIT免疫染色：EB：在明胶涂覆细胞培养板上培养EBs；支架/EB：在EG上培养EBs；ESCs/Ser：在没有EG的明胶涂覆细胞培养板上共培养EBs和丝裂霉素C处理的支持细胞；支架/EB/Ser：在EG上共培养EBs和丝裂霉素C处理的支持细胞。

图4.在四个实验组中，在诱导分化的第3天（a）和第7天（b）进行MVH免疫染色：EB：在明胶涂覆细胞培养板上培养EBs；支架/EB：在EG上培养EBs；支架/EB/Ser：在EG上共培养EBs和丝裂霉素C处理的支持细胞；ESCs/Ser：在没有EG的细胞培养板上共培养EBs和丝裂霉素C处理的支持细胞。

图5.免疫细胞化学染色，比较四个实验组在分化第3天和第7天表达c-KIT和MVH的细胞百分比：EB：在明胶涂覆细胞培养板上培养EBs；支架/EB：在EG上培养EBs；支架/EB/Ser：在EG上共培养EBs和丝裂霉素C处理的支持细胞；ESCs/Ser：在没有EG的细胞培养板上共培养EBs和丝裂霉素C处理的支持细胞。星号表示显著差异（p≤0.05）。

图6.用于细胞表型测定的流式细胞仪分析。在四个实验组中，在诱导分化的第3天和第7天表达c-KIT或MVH的细胞百分比：EB：在明胶涂覆细胞培养板上培养EBs；支架/EB：在EG上培养EBs；支架/EB/Ser：在EG上共培养EBs和丝裂霉素C处理的支持细胞；ESCs/Ser：在没有EG的细胞培养板上共培养EBs和丝裂霉素C处理的支持细胞。*和†分别表示与EB和EB/Ser的显著差异。

图7.比较实验组间分化第7天多能性基因（Oct4，c-Kit，Nanog，c-Myc）和种系基因（GCNA，Stella，MVH，Stra8，Piwil2，DAZL）的相对表达（倍数）。将支架/EB组（在EG上培养EBs）与EB组（在明胶涂覆细胞培养板上培养EBs）中的表达水平进行比较。将支架/EB/Ser组（在EG上共培养EBs和丝裂霉素C处理的支持细胞）与EB/Ser组（在没有EG的明胶涂覆细胞培养板上共培养EBs和丝裂霉素C处理的支持细胞）进行比较。星号表示显著差异（p≤0.05）。