DOI:10.1016/j.actbio.2020.08.017
在临床实践中，引导性骨再生（GBR）的概念已被广泛用于治疗颌面部骨缺损。但是，目前可用的GBR膜的修复功效通常因其有限的骨再生潜力和抗菌活性不足而受到影响。在这项研究中，受常用Bio-Gide®膜的双层结构设计的启发，研究者将溶液静电纺丝书写（SEW）和溶液静电纺丝（SES）技术结合起来，使用单台SEW打印机，设计并制备了一种新型多功能双层“GBR支架”。将负载铜的介孔二氧化硅纳米粒子（Cu@MSNs）掺入聚乳酸-乙醇酸/明胶（PLGA/Gel，表示为PG）纤维基质中，以构建PG-Cu@MSNs复合纤维支架。所制备的GBR支架由疏松多孔的SEW层和致密紧凑的SES层组成，前者用于支撑和促进骨骼向内生长，后者用于抵抗非成骨细胞的干扰。由此产生的增强的机械性能、协调的降解曲线和简便的制备过程赋予了复合支架良好的临床可行性。体外生物学实验表明，PG-Cu@MSNs复合支架具有良好的成骨和抗菌性能。此外，体内大鼠牙周缺损模型进一步证实了PG-Cu@MSNs支架的骨再生功效。综上所述，具有分层结构，同时具有成骨和抗菌功能的电写Cu@MSNs掺杂双层支架在GBR中具有广阔的应用前景。
图1.示意图显示了双层电写PG-Cu@MSNs支架的制备过程和应用场景。（A）双层PG-Cu@MSNs GBR支架是使用一台SEW打印机通过简便的两步工艺制备的。通过将致密层纳米纤维沉积到预印制的松散层支架上，可以制备由松散且多孔的SEW层和致密且紧凑的SES层组成的双层复合支架。（B）双层GBR支架在颌面部和牙槽骨再生区域中的应用示意图。致密层设计为抵抗非成骨细胞干扰，而松散层设计为促进祖细胞粘附，促进细胞-支架相互作用，并在支架降解时支持骨再生。此外，治疗性铜离子以受控方式释放来提供促进成骨作用和抑制细菌的作用。
图2.Cu@MSNs的表征。（A）MSNs和（B）Cu@MSNs的TEM形态。（C）所制备的Cu@MSNs的EDS光谱和（D）EDS映射图像。
图3.（A-F）SEM图像分别显示了PG、PG-MSNs和PG-Cu@MSNs支架的松散层形态（A-C放大130倍；D-F放大60倍）。（G-L）SEM图像分别显示了PG、PG-MSNs和PG-Cu@MSNs支架的致密层形态（G-I放大1000倍；J-L放大500倍）。
图4.双层支架的形态。（A）松散，（B）致密和（C）双层支架的宏观外观。（D）双层支架的厚度测量。（E）双层支架的横截面外观放大图。（F）双层支架，（G）致密层膜和（H）松散层支架的横截面SEM图像。
图5.双层支架的表征。（A）MSNs，Cu@MSNs，PLGA，凝胶和双层支架的FTIR光谱。（B）铜离子在PG-Cu@MSNs复合支架中的体外释放行为。分别在（C）PBS溶液和（D）人工唾液中孵育的双层支架的体外降解曲线。
图6.双层支架的机械性能。（A）代表性应力-应变曲线（插图：初始阶段的应力-应变行为）。（B）双层支架的极限拉伸应力，（C）断裂伸长率和（D）杨氏模量。
图7.双层支架的细胞相容性。（A）在第1、3和5天与双层支架共培养的BMSCs的活/死染色。与双层支架共培养的（B）BMSCs和（C）L929细胞的CCK分析。
图8.（A）在第1、4和7天，致密层膜上培养的L929细胞和（B）松散层支架上培养的BMSCs的F-肌动蛋白和细胞核染色。
图9.细胞浸润评估。7天后（A）在致密层上培养的L929细胞和（B）在松散层支架上培养的BMSCs的SEM图像。7天后，（C）在致密层上培养的L929细胞和（D）在疏松层支架上培养的BMSCs的共聚焦扫描和3D重建图像。7天后，对（E）在致密层上培养的L929细胞和（F）在疏松层支架上培养的BMSCs进行横截面HE染色。（黑色和红色箭头分别代表细胞和支架）
图10.体外成骨分析。（A）ALP染色和（B）在不同双层支架上培养4天和7天的BMSCs中的ALP相对活性。（C）ARS染色和（D）在不同双层支架上培养21天的BMSCs的ARS相对活性。（E）在不同双层支架上培养7天的BMSCs的OCN免疫荧光染色。红色、绿色和蓝色荧光分别代表AF 594染色的OCN，FITC鬼笔环肽染色的细胞骨架和DAPI染色的细胞核。成骨相关基因（F）RUNX2，（G）ALP，（H）ColI和（I）OCN在不同双层支架上培养7天的BMSCs中的表达。结果显示为TCP组中的相对表达水平。
图11.体外抗菌活性检测。孵育24小时后，PG、PG-MSNs和PG-Cu@MSNs支架对（A）大肠杆菌和（B）金黄色葡萄球菌的抑制区。在24小时的孵育期内，与不同双层支架共培养的（C）大肠杆菌和（D）金黄色葡萄球菌的细菌溶液的OD值。在24小时的观察期内，PG、PG-MSNs和PG-Cu@MSNs支架对（E）大肠杆菌和（F）金黄色葡萄球菌的细菌抑制率。
图12.体内骨再生评估。（A）2D和3D重建显微CT图像显示了缺损前的牙槽骨和未经治疗以及用PG、PG-MSNs和PG-Cu@MSNs支架治疗的缺损周围的牙槽骨。（B-D）通过测量支架植入前后的CEJ-ABC距离以及再生骨组织的BV/TV和BMD值对垂直骨增益进行定量评估。（E）代表性的H＆E和Masson染色图像显示了支架引导的牙周骨再生。（AB：宿主牙槽骨，NAB：新生牙槽骨，PDL：牙周膜，DE：牙根周围的牙本质，G：牙龈组织，黑色箭头表示CEJ，黄色圆圈表示血管）
