DOI:10.1016/j.msec.2020.111354

人类诱导多能干细胞（hiPSCs）衍生的心肌细胞（hiPSC-CMs）已被用于心脏再生和修复以及体外3D心脏组织模型的开发。现有的hiPSCs心肌分化方案采用了2D培养系统。然而，hiPSCs在3D培养体系中向心肌细胞分化的效率尚未得到广泛的研究。本研究探索了在3D纳米纤维支架上hiPSCs向功能性心肌细胞分化的效率。通过静电纺丝法制备了同轴聚己内酯（PCL）-明胶纤维支架，并使用扫描电子显微镜（SEM）和傅立叶变换红外（FTIR）光谱对其进行了表征。在纳米纤维支架上培养hiPSCs并使其分化为功能性心肌细胞，与2D培养物进行比较。通过SEM、免疫荧光染色和基因表达分析来评估两种系统的相对效率。2周后在2D培养物中观察到分化的心肌细胞收缩，而4周后在3D培养物中观察到该现象。SEM分析显示，2D和3D培养中分化的细胞形态没有显著差异。但是，基因表达数据显示3D培养物中心脏祖细胞基因（ISL-1，SIRPA）的表达显著增加，而2D培养物中心肌细胞标志物（TNNT，MHC6）的表达显著增加。相反，免疫荧光染色显示NKX-2.5和α-肌节肌动蛋白的表达没有实质性差异。此外，在3D纤维支架中观察到原位分化的心肌细胞的均匀迁移和分布。总体而言，该研究表明，同轴PCL-明胶纳米纤维支架可用作3D培养平台，将hiPSCs有效分化为功能性心肌细胞。

图1.静电纺丝支架的表征。（A）SEM图像显示PCL-明胶同轴支架的随机排列。（B）明胶、PCL和PCL-明胶同轴支架的SEM图像。（C）明胶、PCL和同轴纳米纤维支架的ATR-FTIR分析。

图2.在2D和3D PCL-明胶同轴支架上培养的hiPSCs的比较评估。（A）培养72小时后hiPSC菌落的相衬图像。比例尺：I：200µm；II：100µm。（B）在2D（I-II）和3D（III-IV）培养体系中培养的hiPSCs的SEM图像。比例尺：I：50µm；II，IV：10µm；III：100µm。（C）荧光图像显示在2D（I-IV）和3D（V-VIII）的hiPSCs培养物中PSC标志物OCT4和SSEA4的表达。比例尺：50µm。

图3.（A）在2D（I-III）和3D（IV-VI）培养体系中培养的hiPSCs的活性染色。代表性荧光图像显示了2D和3D培养体系中的活细胞（钙黄绿素AM，绿色）和死细胞（BOBO-3碘化物，红色）。比例尺：400µm。（B）在2D和3D培养体系中测定的乳酸脱氢酶（LDH）释放。n=4，NS：*p>0.05。

图4.在2D和3D培养体系中hiPSCs心肌分化的形态学和功能评估。（A）在D14（A）和D28（B）的2D培养和3D培养（C）中分化为心肌细胞的hiPSCs的相衬图像。比例尺：500µm。（D）在2D培养（黑色）和3D培养体系（红色）中，分化为功能性心肌细胞的hiPSCs的跳动频率定量评估。（E）SEM图像显示在D14和D28的2D（I-II，V-VI）和3D（III-IV，VII-VIII）培养体系中由hiPSCs培养和分化为功能性心肌细胞的细胞表面形态。比例尺：I-IV：50µm；V＆VI：30µm；VII：5µm；VIII：10µm。

图5.在D7的2D和3D培养体系中，hiPSCs心肌分化的免疫荧光分析。共聚焦图像显示了在2D（A-C）和3D（D-G）的hPSCs心肌分化过程中心脏祖细胞标志物NKX-2.5在D7的表达。比例尺：A-C：50µm；D-G：250µm；插图（D-F）：20µm。黄色虚线表示同轴支架。

图6.在D28的2D和3D培养体系中，hiPSCs心肌分化的免疫荧光分析。共聚焦图像显示了在2D（A-C）和3D（D-G）的hiPSCs分化过程中心肌细胞标志物肌节α-肌动蛋白（α-SA）的表达。比例尺：50µm。黄色虚线表示同轴支架。红色和白色箭头分别表示纤维和细胞。

图7.在2D和3D培养的hiPSCs心肌分化过程中，心脏祖细胞（CP）和心肌细胞标志物的基因表达分析。条形图显示了在D0、D7和D28，2D和3D培养的心肌分化中CP相关基因SIRPA（A）和ISL1（B）以及心肌相关基因MHC6（C）和TNNT2（D）的表达相对于D0（未分化的hiPSCs）表达的倍数变化。数值表示为平均值±SEM，n=3；***p<0.001；D代表天。