DOI: 10.1039/D0BM00833H

越来越多的证据表明，三维（3D）体外细胞培养系统在模拟天然体内微环境方面，优于传统的二维（2D）单层培养。将组织工程3D培养模型与干细胞技术相结合，有助于深入研究阿尔茨海默氏病（AD）的发病机理。然而，现有的AD三维神经元模型过表达突变基因或在组成、生物学特性和细胞分化阶段具有异质性。在此，研究者将患者的诱导性多能干细胞（iPSC）衍生的神经祖细胞（NPC）封装在通过湿法静电纺丝制备的聚乳酸-乙醇酸（PLGA）微形态支架中，以开发AD的新型3D培养模型。首先，研究者通过优化各种工艺参数（例如纤维直径、孔径、孔隙率和亲水性）来增强支架内的细胞浸润和分布。接下来，比较了2D单层对照和3D培养中神经干细胞的关键特征，包括活性、增殖和分化。3D微纤维基质可减少细胞增殖，并在培养7天之内显著加速神经元分化。此外，与年龄匹配的健康对照组相比，3D培养可自发地增强携带家族性AD（FAD）突变的分化神经元中的致病性淀粉样β42（Aβ42）和磷酸化tau水平。总体而言，基于可调节支架的3D神经元培养平台可作为一种合适的体外模型，该模型可有力地再现并加速FAD-iPSC衍生神经元的致病特征。

图1.3D PLGA超细纤维支架的制备和孔径优化。（A）湿法静电纺丝工艺示意图；（B）3D PLGA支架的孔径随微纤维浓度的变化而变化；（C）FE-SEM显微照片，分别显示2D和3D支架中的微纤维形态和分布（比例尺：10µm）；PLGA（D）2D和（E）3D超细纤维支架的孔径分布；数据表示为平均值±SD（n=3）。

图2.3D PLGA超细纤维支架的表征。（A）3D微纤维支架在等离子体处理之前和之后的水接触角；（B）PLGA微纤维表面的低分辨率XPS光谱：（a）不使用和（b）使用大气等离子体处理（300s）；（C）在干燥和潮湿条件下测试的3D PLGA超细纤维支架的应力-应变曲线；（D）干湿条件下测定的压缩模量；数据表示为平均值±SD（n=5），***p<0.001。

图3.3D PLGA超细纤维支架内NPC的封装和表征。（A）hESC/iPSC衍生神经细胞培养示意图，说明了2D和3D培养的轨道式接种（80rpm；20分钟）、分化方案和染色时间表。（B）共聚焦荧光显微镜图像，其显示（i）切片后的3D微纤维支架的横截面（虚线表示3D支架的顶面）；（ii，iii）通过对D13上的TuJ1（绿色）和Nestin（红色）标记物进行染色以评估3D支架中iPSC衍生NPCs（8529细胞系）的细胞浸润、分布和分化；（iv）通过Ki67（绿色）标记物评估细胞增殖，（v）通过D13上的hESC衍生NPCs的TuJ1（红色）标记物显示有神经突形成的细胞分化；细胞核用DAPI复染（蓝色）；（vi）支架横截面的SEM图像，显示了在2000放大倍率下的细胞形态及其在超细纤维上的附着情况。

图4.3D PLGA超细纤维支架支持封装细胞的存活。（A）共聚焦荧光显微镜图像显示对D13和D19上的裂解caspase 3（CC3）（红色）标记物进行染色以评估2D和3D培养中的细胞死亡。细胞核用DAPI复染（蓝色）；（B）免疫染色结果的定量，显示在D13和D19上标准化为DAPI的细胞死亡标记物CC3的阳性染色百分比；数据表示为平均值±SD（n=3），*p<0.05，**p<0.01；比例尺：50µm。

图5.3D PLGA超细纤维支架降低了细胞增殖率。（A）共聚焦荧光显微镜图像，表明在2D和3D培养物中hESC衍生NPC的增殖，如在D13和D19上的Ki67（绿色）标记物染色；细胞核用DAPI复染（蓝色）；（B）免疫染色结果的定量，显示在D13和D19上标准化为DAPI的细胞增殖标记物Ki67的阳性染色百分比；（C）在D19上通过2D和3D形式培养的细胞中Ki67表达的qPCR分析；数据表示为平均值±SD（n=3），*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；比例尺：50µm。

图6.3D PLGA超细纤维支架可加速神经元分化。（A）共聚焦荧光显微镜图像，表明对D13和D19上的TuJ1（红色）和NeuN（红色）标记物进行染色以评估2D和3D培养物中hESC衍生的神经元分化；细胞核用DAPI复染（蓝色）；（B）免疫染色结果的定量，显示在D13和D19上标准化为DAPI的神经元分化标记物Tuj1和NeuN的阳性染色百分比；（C）在D19上通过2D和3D形式培养的细胞中NeuN表达的qPCR分析；数据表示为平均值±SD（n=3），**p<0.01，***p<0.001；比例尺：50µm。

图7.3D PLGA超细纤维支架可扩增AD致病标记物的表达。（A）2D培养和（B）3D培养的对照（8529，4148）和FAD（6840，9908）细胞系中Aβ42表达水平的ELISA分析；（C）Western印迹，描绘了2D和3D培养的对照和FAD细胞系中p-tau的水平；基于Western blot，定量（D）2D培养和（E）3D培养的对照和FAD细胞系中的p-tau水平；数据表示为平均值±SD（n=3），*p<0.05，**p<0.01。