DOI: 10.1039/D0EN00268B

本研究旨在创建一种适用于细菌生物膜开发的固态纳米结构支架，该生物膜使细菌能够成功地抵抗恶劣的营养和环境条件，具有潜在的应用价值。作为一个模型系统，研究者将自立式静电纺纳米结构聚ε-己内酯基支架（EN-PCLS）与伯克霍尔德菌细胞结合在一起。制备支架结构的目的包括构建微珠和纳米纤维，并在微尺度和纳米尺度上模拟土壤的3D形态和空间结构，从而有利于开发合适的生物膜。由此产生的3D框架显示出广泛的孔隙率和孔隙互连性，并且蜂窝蜡细胞样排列在土壤中复制出较大的孔。细菌首先在EN-PCLS上沉积一层调节膜，以促进粘附。研究者优先在纳米纤维上观察到细菌附着，这些细胞通常会沿着纤维定向，并且在搅拌下一直持续到孵育后期，如果珠子上没有纳米纤维，则珠子会呈无细菌状态。随着时间的流逝，这种相互作用在附属物形成和释放细胞外聚合物（EPS）的稳定性方面得到了改善。这导致与纳米纤维之间更稳定的粘附，并具有增强的定植性，以及在EN-PCLS的蜂窝蜡细胞状框架内部的纳米纤维区域中形成扁平的细菌聚集体。此外，形成了3D微菌落和大菌落，其悬挂在蜂窝蜡细胞壁微珠之间的纳米纤维上。这种微生物组织在孵育7天后演变成成熟的3D生物膜，细菌在其中形成紧密堆积的细胞层，其嵌入并由覆盖整个EN-PCLS的EPS基质包裹。在生物膜形成的最后阶段（11天），生物膜和支架框架都出现了部分降解，后者可能被用作碳源。因此，与传统研究相比，观察到的类似土壤的3D纳米结构成功地使土壤细菌能够在更自然的支架上形成生物膜。该策略有望创造出一种支架，作为成功的纳米生物技术载体，用于农业（营养供应和植物病害的控制）和环境（污染土壤和废水的生物修复）领域中。

图1.不同水平的土壤颗粒聚集和参与的有机体（主要是微生物和根）形成土壤结构的示意图。本研究中旨在模拟的水平由深红色矩形突出显示。

图2.原始电纺纳米结构（珠和纤维）PCL支架-1（EN-PCLS1）的光学图像和SEM显微照片。（A）EN-PCLS1的光学图像，顶视图。（B）EN-PCLS1的光学图像，侧视图。（C）薄区的SEM显微照片（放大65倍），显示蜂窝蜡细胞状排列，俯视图。（D）厚区的SEM显微照片，显示出由蜂窝蜡细胞状排列产生的薄片和尖峰，俯视图。（E）厚区横截面的SEM显微照片，显示与蜂窝蜡细胞壁向上延伸相对应的薄片和尖峰的珠子和纤维骨架的细节，相对的空腔显示为通道或沟槽，其中纤维更明显（黄色箭头）；插图为蜂窝蜡细胞状排列壁（尖峰）上微珠的细节，通常看起来是融合的。比例尺：（A）=1 cm；（B）=1 mm；（C）=200 µm；（D）=500 µm；（E）=200 µm（插图=100 µm）。

图3.原始电纺纳米结构（珠和纤维）PCL支架-2（EN-PCLS2）的光学图像和SEM显微照片。（A，B）膜的蜂窝蜡细胞状排列，光学显微镜和SEM。（C）SEM显微照片显示通过静电纺丝微珠和纤维沉积衍生出的蜂窝蜡细胞状排列的俯视图。（D）微珠和纤维框架横截面的光学显微镜图像（红色和浅蓝色箭头）。（E）SEM显微照片显示静电纺丝后蜂窝蜡细胞状排列的壁，这些壁通常由微珠组成（绿色箭头）。（F）SEM显微照片详细显示了构成电纺织物的微珠（橙色箭头）和纳米纤维（浅蓝色箭头）之间的尺寸比例。（G）SEM显微照片详细显示了组成电纺织物的纳米纤维；橙色箭头=单纳米纤维；白色箭头=分裂的纳米纤维。比例尺：（A）=2.4 mm；（B）=2 mm；（C）=100 µm；（D）=40 µm；（E）=200 µm；（F）=10 µm；（G）=1 µm。

图4.电纺纳米结构PCL支架（EN-PCLSs）的表征：A）沉积后原始EN-PCLS2中珠子直径的分布。（B）沉积后原始EN-PCLS2中纤维直径的分布。（C）在沉积和与细菌孵育3小时后，原始EN-PCLS2的蜂窝蜡细胞状排列中的腔直径分布。D）EN-PCLSs的接触角（EN-PCLS1和EN-PCLS2的液滴量分别为8µl和7µl）。在纳米骨架的SEM显微照片中测量EN-PCLS2不同结构（珠、纤维和空腔）的尺寸（n=220（A）；n=145（B）；n=135（C））。结构的平均值和中值显示在相关图中。

图5.在B.terricola细胞悬浮液中孵育3小时后的EN-PCLSs的SEM显微照片：（A）当细菌将其沉积在腔内但靠近壁的纳米纤维网络上时，条件层（CF）形成膜。蜂窝蜡细胞状结构（浅蓝色箭头）；橙色箭头=被CF覆盖的微珠。（B）CF在蜂窝蜡细胞状结构的纳米纤维腔中大量沉积（浅蓝色箭头）；黄色箭头=从涂层突出的微珠聚集体。比例尺：（A）=10 µm；（B）=100 µm。

图6.SEM显微照片表明在培养过程中，B.terricola细胞普遍附着在EN-PCLSs纳米纤维上。（A）细菌在孵育5小时后开始粘附在接近蜂窝蜡细胞状排列腔壁的纳米框架上；淡蓝色箭头=经5小时孵育和细胞使其沉积后，条件层（CF）在蜂窝蜡细胞样结构内的纳米纤维网络上形成膜；黄色和粉红色箭头=蜂窝蜡细胞状结构壁中的微珠和包埋在纳米纤维网络中的单个微珠的聚集体，表明没有细菌附着在其上；橙色和红色箭头=B.terricola细胞分别附着在空腔和微珠上的纳米纤维上；黄色圆圈=外膜囊泡（OMV）分布在纳米纤维上并成簇聚集；（B）在培养的早期阶段（5小时），B.terricola细胞和纳米纤维的相互作用；粉色箭头=i）细菌细胞与纳米纤维之间非常紧密的相互作用，指出了这两种成分之间的大小差异很大；ii）聚合物基质包围细菌细胞并包裹CF涂覆的纳米纤维，iii）OMVs附着在细菌表面和接口处；橙色箭头=CF沉积后较大尺寸的纳米纤维。（C）在培养的早期阶段（5小时），B.terricola细胞和微珠的相互作用；红色箭头=细菌细胞仅在存在纳米纤维的地方粘附到微珠上；粉色箭头=细菌细胞悬挂在纳米纤维上；黄色箭头=CF涂覆微珠。（D）孵育48小时后，B.terricola细胞与微珠的相互作用；淡蓝色箭头=细菌附着在微珠上，只要后者被纳米纤维覆盖；橙色箭头=没有纳米纤维沉积的无细菌微珠。比例尺：（A）=10 µm；（B）=1 µm；（C）和（D）=5 µm。

图7.B.terricola细胞与EN-PCLSs的稳定附着：（A）SEM显微照片表明孵育28小时后，B.terricola细胞开始形成附着物，这些附着物在径向分布后锚定在纳米纤维网络上（橙色箭头）和彼此结合（浅蓝色箭头）；绿色箭头=B.terricola细胞呈球形（其他细胞呈卵形形态）。（B）粘附于微珠的B.terricola细胞的TEM显微照片：绿色箭头=细菌附属物，使细胞附着于微珠；浅蓝色箭头=CF沉积在微珠上；粉色箭头=缺少CF的微生物表面；红色箭头=囊泡将微生物附属物连接到CF涂层的微珠表面（实心箭头），或无涂层的微珠表面（虚线箭头）；插图=电子致密囊泡和明亮核囊泡的横截面（分别是虚线的红色和蓝色环）。（C）孵育48小时后，B.terricola细胞的SEM显微照片显示出球形（绿色箭头）和卵形形态。（D）孵育28小时后，B.terricola细胞的TEM显微照片，在某些情况下与纳米纤维直接相互作用，此处通常表现为横向和纵向截面（橙色箭头）。比例尺：（A）和（B）=1 µm；（C）和（D）=2 µm。

图8.孵育5 h至28 h后，B.terricola细胞定植EN-PCLSs的SEM显微照片：（A）孵育5 h后，悬挂在蜂窝状结构中悬浮纳米纤维上的杆状细胞的微菌落形成。（B）在20小时的温育期后，细菌微菌落在EN-PCLSs的微小纳米纤维上显示出优先的生长和扩大；橙色箭头=穿过菌落的孔。（C）孵育28小时后观察到B.terricola细胞对EN-PCLSs的广泛定殖：显示的区域靠近蜂窝蜡细胞状排列的腔壁；黄色箭头=空腔纳米纤维网络的定植；淡蓝色箭头=在存在纳米纤维网络的情况下，微珠之间的空间定植。（D）孵育28小时后，B.terricola细胞的3D微菌落普遍位于微珠之间的空间（粉红色箭头）；橙色箭头=穿过菌落的孔。比例尺：（A）=2；（B）和（C）=5 µm；（D）=10 µm。

图9.培养48小时后，B.terricola细胞定植EN-PCLSs的SEM和TEM显微照片：（A）B.terricola细胞3D大菌落的SEM显微照片，当存在纳米纤维网络时，其优先位于微珠聚集体之间的广阔空间中；淡蓝色箭头=纳米纤维网络作为支撑，以形成大菌落；橙色箭头=穿过菌落的孔。（B）SEM显微照片显示当这种基质逐渐封装和包埋细菌细胞时，EPS释放及其参与细菌间以及与EN-PCLSs之间稳定相互作用的形成。（C）TEM显微照片显示被EPS包围的细菌细胞，以细胞周围的黑色晕圈出现。比例尺：（A）=10；（B）=1 µm；（C）=2 µm。

图10.在纳米结构PCL织物表面形成生物膜的过程中，通过将INT还原为甲瓒，可以测量B.terricola细胞的存活率和代谢活性。（A）和（B）EN-PCLSs的图片显示红色的变化和分布，这是由于INT显著还原为甲瓒所致，并且与定植纳米结构织物中细菌的程度变化和细菌扩散有关：（A）首先在膜的边界发生EN-PCLSs的定植；（B）向内进行定植，直到遍布整个纳米框架。（C）基于从EN-PCLS中提取的甲瓒在495nm处的吸光度，然后标准化为EN-PCLSs的大小（即1 mm2），在孵育期（11d）内细菌种群生长的动态；插图显示在不同孵育期采样的EN-PCLSs上INT-甲瓒的程度，并且与垫子上细菌种群的生长和代谢活性有关。

图11.孵育7天后在EN-PCLS上形成的B.terricola生物膜的SEM显微照片（BEN-PCLSs）。（A）在EPS基质中嵌入一层致密的细菌，总体上形成覆盖EN-PCLSs的均匀涂层，从而产生年轻的生物膜（BEN-PCLSs）；绿色箭头=没有沉积纳米纤维的微珠仍然呈无细菌状态；黄色箭头=穿过菌落的孔；淡蓝色箭头=表面上带有纳米纤维的微珠可容纳细菌，具体取决于沉积的纳米纤维的数量。（B）BEN-PCLSs的概述表明，在微生物群落进化的这一阶段，由于细菌含量高以及EPS涂料的广泛存在，几乎无法识别出纳米结构织物的原始蜂窝蜡细胞样结构（图11b，黄色圆圈）。（C）在BEN-PCLSs上形成的成熟生物膜的概述，其中EPS形成了一层厚的基质，既包埋细菌细胞又包埋了纳米纤维骨架，最终看上去像毯子一样覆盖在膜上（粉红色箭头）；绿色箭头=从EPS基质突出的细菌菌落；黄色箭头=穿过菌落的孔。比例尺：（A）=10；（B）=200 µm；（C）=5 µm。

图12.SEM显微照片显示，孵育11天后，B.terricola细胞在EN-PCLSs上产生的生物膜降解情况。（A）覆盖在BEN-PCLSs上的EPS涂层的部分降解，以广泛的裂口突出（绿色箭头）显示；（B）顶部EPS涂层下方细菌菌落化的纳米框架的降解，显示出微珠（粉红色箭头）和支撑细菌菌落的纤维网络（橙色箭头）（浅蓝色箭头）均破裂。（C）覆盖BEN-PCLSs的EPS涂层的多层组织，出现撕裂现象（黄色箭头）。（D）从降解引起的裂纹可见EPS涂层的厚度（浅蓝色箭头）。比例尺：（A）=20；（B）=10 µm；（C）=1 µm；（D）=20 µm。

图13.比较了本研究中确定的目标，即在微尺度和纳米尺度水平上模拟3D土壤结构的3D纳米结构织物的创建，以便更“自然地”被细菌定植，直到形成适当的成熟生物膜，以及相关结果。（A）由各种固体颗粒（淤泥、粘土和氧化物）和有机物（微生物碎片和腐殖质）的聚集体组成的土壤概念模型示意图，以及在微尺度上天然土壤聚集体的3D图像（B）。草图中的组件已根据相对平均尺寸进行了复制。（B）中的黄色矩形指出了典型的土壤小颗粒。（C）此处制作的3D电纺纳米结构框架（EN-PCLS）的草图，由小球和纤维组成，分别用于再现真实土壤中的固体颗粒和纤维状有机物，以及生成的真实EN-PCLS的图像（D）。（D）中的黄色矩形突出显示了与（B）中尺寸相似的微珠和纤维状有机材料聚集体的存在。（E）（A）中细菌定植土壤聚集体的草图，以及生物膜形成细菌（F）定植的天然土壤微聚集体的3D图像。（H）在被细菌定植时制作的EN-PCLSs的示意图，以及在成熟生物膜形成后被细菌定植的EN-PCLS的图像（G）。（F）图片由东北大学的刘易斯实验室提供。