DOI: 10.1002/bit.27465

本研究开发了一种微创、可靠且廉价的技术，能够实时监测生物材料支架上的细胞反应，改善基于支架的组织工程策略的最终结果。为了建立原位生物活性与细胞命运之间的相关性，研究者开发了一套完整的工作流程，用于在电纺网格上对纯小胶质细胞培养物中时空变化的胞质钙振荡进行实时体积成像。在随机取向电纺纤维上培养的HMC3细胞用荧光染料染色，并用激光扫描共聚焦显微镜成像。在不影响空间和时间分辨率的情况下，共振扫描在获得细胞内钙水平的时程方面提供了高分辨率。3D重建和深度编码使细胞位置和细胞内钙水平的可视化随样品厚度发生变化。重要的是，根据生化线索和变化的基质结构，即随机取向和定向纤维，对细胞形态的变化和响应中的原位钙峰值进行定量。从峰值数据生成的栅格图显示了特定于培养条件的钙签名。将来，该方法可用于阐明钙签名与细胞表型/激活之间的相关性，并促进生物医学应用支架的合理设计。

图1：该方案的工作流程：聚合物基质制备，在基质上培养的细胞的共聚焦成像，成像方式，共振扫描和3D图像重建。

图2：（a）随机取向PLGA纤维的SEM图像（比例尺：10μm）和（b）HMC3细胞在随机取向PLGA纤维上的明场显微镜图像（比例尺：100μm）。

图3：2D DIC尺寸缩小后的压缩z-stack图像，在未经和经ATP处理的情况下，对随机取向PLGA纤维上培养的HMC3细胞进行Fluo-4染色的荧光和共聚焦图像。比例尺代表100 µm。

图4：从Fluo-4染色HMC-3细胞获得的2D和压缩z-stack（3D合并）强度分布的比较：（a）2D单焦平面的共焦图像，（b）通过压缩32个z-stack获得的共焦图像，（c）从单个平面获得的Fluo-4强度的延时，（d）从压缩的z-stack图像中获取的Fluo-4强度的延时。图（a）和（b）中的比例尺为100 µm，插图显示了更高放大倍数的细胞。

图5：随机取向纤维上的小胶质细胞：（a）纤维网络内细胞的3D深度编码图像，（b）仅细胞的3D深度编码图像（未显示纤维），（c）纤维网络中的Fluo-4染色细胞的荧光图像和（d）仅Fluo-4染色细胞的荧光图像（未显示纤维），（e）在不同深度存在的三个代表性细胞的z-stack图像和（f）荧光强度热图。比例尺代表100 µm。（c）图中的箭头指向细胞。

图6：延时荧光强度图谱：随机取向PLGA纤维上培养的单个细胞（即三个代表性Fluo-4染色的HMC3细胞）中的钙振荡：（a）未经和（b）经ATP处理。所有图的比例尺代表20 µm。

图7：从图像中提取钙尖峰数据：五个代表性Fluo-4染色HMC3细胞的压缩z-stack图像：（a）未经和（c）经ATP处理。（b）未经和（d）经ATP处理的五个细胞中400 s内相应的钙离子峰值时间曲线。

图8：在ATP处理之前和之后，在随机取向的PLGA纤维上生长的小胶质细胞中钙尖峰的比较：（a）最大振幅，（b）尖峰峰数/400 s。在随机取向PLGA纤维上培养的Fluo-4染色的HMC3细胞中钙峰值位置的光栅图：（c）不含ATP和（e）含ATP。图（d）和（f）中显示了相应的Pearson相关矩阵。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。

图9.用ATP处理，在定向PLGA纤维上培养的Fluo-4染色的HMC3细胞：（a）定向PLGA纤维的SEM图像（比例尺：10μm），（b）带有深度编码的3D重建图像（比例尺：100 µm），（c）压缩的z-stack图像，描绘了五个细胞内的钙通量（比例尺：100 µm），（d）相应的栅格图显示五个细胞在400 s内的钙峰值位置。

图10：随机取向和定向电纺纤维的纤维结构和细胞形状/钙峰值响应的比较：（a）纤维直径，（b）纤维角度标准偏差，（c）胞长轴长度，（d）胞长宽比，（e）钙振荡的最大幅度，（f）尖峰峰数/400 s。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。