DOI:10.1016/j.cej.2020.125939

外泌体作为一种先进的载体，由于其优异的生物相容性、高效的细胞摄取和简便的靶向修饰，在基因和药物递送中得到了广泛的应用。除了生物活性分子的常规可控递送外，一些其他外泌体的作用还需要进一步探索。在此，研究者报告了一种构建特异性基因激活的工程外泌体，它不仅可以有效调节血管内皮生长因子165（VEGF165）的基因释放，而且在增强血管化骨再生的治疗中也发挥着关键作用。该研究表明，通过基于外泌体的载体，VEGF165质粒基因的转染效率大大提高。单独的外泌体和工程外泌体在体外均表现出一定的间充质干细胞（MSC）成骨细胞分化。更重要的是，基于对大鼠体内临界尺寸颅骨缺损模型的评估，内化VEGF165基因并结合电纺纳米纤维膜的工程外泌体在成骨和血管生成中起着双重作用。因此，当前的工作创造了一种基于双功能工程外泌体的生物材料，可指导体外干细胞分化并促进体内血管化骨再生，从而将外泌体的应用范围从简单的生物分子载体扩展到外泌体增强疗法。

图1.本研究的总体思路。（A）通过电穿孔将VEGF165质粒基因封装到ATDC5衍生的外泌体中。（B）通过细胞摄取将基因激活的外泌体内化为间充质干细胞（MSC）。（C）通过摄取工程化外泌体成功诱导了MSC的成骨分化。（D）VEGF165的蛋白表达完成并被递送以调节细胞命运。（E）制备电纺纳米纤维膜并用聚多巴胺对其进行改性。（F）将基因激活的工程外泌体连接到聚多巴胺修饰的纳米纤维膜中，以构建工程外泌体激活基质。（G）通过在大鼠临界尺寸颅盖缺损的表面覆盖工程外泌体激活基质来介导血管化成骨作用。（H）在愈合过程中，新生血管的密度从早期到晚期逐渐降低。

图2.ATDC5衍生外泌体的表征。（A）通过TEM观察外泌体的形态。（B）外泌体特异性蛋白的蛋白质印迹结果。（C）通过NTA测量外泌体的粒度分布和数量浓度：外泌体的平均粒径为111.4 nm，半峰全宽（FWHM）为74.1 nm，原始浓度为5.2×1010粒/mL。（D）由NTA捕获的外泌体的动态屏幕截图。

图3.ATDC5衍生的外泌体作为天然质粒载体的功能。（A）通过大鼠骨髓来源的间充质干细胞（BMSCs）评估负载hVEGF165质粒外泌体的摄取情况。质粒被释放到细胞质中，并通过转录和翻译表达并分泌hVEGF165蛋白。（B）将DiI标记的外泌体（橙色斑点）与BMSC孵育并内化3、24和48 h。BMSC的细胞核用DAPI（蓝色）染色。（C）通过cck-8测量BMSC的生长曲线。（D，E）通过Nanodrop 2000和琼脂糖凝胶电泳测量质粒的负载效率。（F，G，H）通过mRNA转录水平、上清液分泌蛋白水平和细胞内蛋白表达水平体外验证质粒转染效率。

图4.ATDC5衍生的外泌体促进了MC3T3-E1的成骨分化。（A，B）MC3T3-E1中成骨基因Runx2、OCN、OPN和hVEGF165的表达证实外泌体和工程外泌体均可诱导MC3T3-E1的成骨分化。（C）ALP染色显示分化趋势随着培养时间的增加而明显增强。（D）茜素红染色清楚地表明，与空白对照相比，外泌体和工程外泌体均显示阳性染色。

图5.电纺纳米纤维薄膜的理化特性和生物相容性评估。（A）电纺纳米纤维材料在聚多巴胺（pDA）改性之前和之后的照片图像。（B）水接触角的结果表明，未经和经过pDA改性的电纺纳米纤维膜没有明显的区别。（C）FTIR的结果证实了这一点。（D）扫描电子显微镜（SEM）结果。（E）通过cck-8测量的生长曲线以研究材料的细胞毒性。通过（F）共聚焦显微镜和（G）SEM观察细胞粘附情况。（H）通过SEM观察材料对外泌体的粘附能力。

图6.动物实验步骤和Micro-CT结果。（A）建立大鼠临界尺寸颅骨缺损模型，并在缺损处放置实验材料。（B）Micro-CT的重建。（C）Micro-CT分析。

图7.血管生成和成骨的组织学结果。（A）在第6周通过H＆E和Masson染色观察骨再生情况。（B）在第4周通过免疫组织化学评估成骨和血管生成。