DOI:10.1038/s41598-020-66281-6

骨缺损是肌肉骨骼手术中的常见问题。自体骨移植的替代物受到移植材料可用性的限制。无菌的松质骨虽然具有骨传导性，但其骨诱导能力有限。纳米纤维支架由于其具有模拟细胞外基质的能力，目前被用于多种用途。此外，它们允许修饰以提供功能特性。在此之前，已证明了静电纺纳米纤维可用于骨骼组织再生。利用I型胶原纳米纤维骨诱导能力的同时，研究者发现减小的支架孔径限制了细胞迁移，从而阻碍了支架的定植。本研究的目的是将间充质干细胞结合到纳米纤维支架的静电纺丝过程中，以生产用于骨替代物的细胞接种纳米纤维支架。构建具有独立可控的纺丝和喷涂装置以用于同时进行静电纺丝和喷涂，并对纺丝工艺进行广泛优化后，体内外评估了所得支架的性能。通过同时静电纺丝和喷涂将从大鼠股骨中分离出的干细胞融合到PLLA（聚乳酸）和PLLA-I型胶原纳米纤维支架（PLLA Col I共混物）中。体外评估其代谢活性、增殖和成骨细胞分化。为了进行体内评估，将支架植入大鼠头骨的临界尺寸缺损处。4周后，处死动物并使用CT扫描、组织学、免疫组化和荧光评估分析骨愈合情况。通过重复纺丝和喷涂条件将间充质干细胞成功整合到支架中，这些条件包括聚合物溶剂、纺丝距离、液体对电极的使用、电极电压和纺丝持续时间。研究表明，体内形成了骨组织。使用PLLA支架，发现无细胞和细胞接种支架的结果相当，而与无细胞的PLLA-胶原支架相比，细胞接种的PLLA-胶原支架显示出明显更好的骨形成。该研究结果为细胞接种纳米纤维支架在大骨缺损中的应用提供了支持。

图1.开发植入细胞支架的步骤和纺丝装置。优化过程的流程图（A）和纺丝设备的示意图（B）1.电压源在0-30 kV之间变化（2个独立）；2.两个液压泵的电机控制；3＆4.带步进电机和螺杆的液压泵；5＆6.2个独立的纺丝头，每个纺丝头由4个注射器组成；7.旋转对电极；8.加湿装置及供气；9.抽气；10.调温灯。

图2.通过多喷嘴静电纺丝获得的PLLA纳米纤维支架的物理表征。多喷嘴静电纺丝（A）和对电极类型（B）对支架质量沉积的影响。通过干（C）或湿（D）对电极制备的纳米纤维。多喷嘴静电纺丝和对电极类型对计算孔径（E）的影响。机械稳定性取决于对电极（G，H）和支架的水容量（F）。

图3.在细胞接种的纳米纤维支架构建过程中影响细胞存活的参数。将DMEM中的细胞悬浮液通过1至4个设备进行电喷涂，其中含100000至400000个细胞，并用2个设备构建支架。流速、电压、溶剂、支架聚合物的纺丝/喷涂距离和时间以及对电极均按文中所述进行了更改。支架制备后直接通过FDA/EtBr（B）染色，每个条件下由6至27个探针进行分析，或者在培养24小时后（A，C，E，F，G），通过MTT分析至少3个支架。通过1至3个设备喷涂不同的彩色墨水，可以看到多个喷涂设备之间的喷射相互作用（D）。由于纺锤体的间距不合适，纳米纤维沉积失败（H）。数据代表平均值和标准偏差。

图4.使用静电纺丝和电喷涂相结合的工艺，掺入PLLA纳米纤维支架的细胞在体外（A-F）和体内（G-L）的生长和存活。将约200000-400000个细胞掺入PLLA纳米纤维支架中，在DMEM培养基中于生长（3个支架）和骨诱导（3个支架）条件下培养22天，使用MTT分析（一式三份）评估其代谢活性。使用5个伊红染色的感兴趣区域分析细胞密度/分布，其中每个区域和时间点（B生长；C骨诱导条件）由3个石蜡包埋的支架组成。使用荧光TUNEL法在每个时间点和条件的3个石蜡包埋支架的至少3个组织切片中测定凋亡（D-F）。对从16个缺损处获得的48个切片（细胞接种组）或从10个缺损处获得的30个切片（对照组）进行体内分析。通过HE染色的石蜡切片（H，I）中的总细胞数（G）测定支架内的细胞密度。注释无细胞区域。通过荧光TUNEL法测定石蜡包埋的组织切片中的细胞凋亡，并进行总细胞计数和阳性细胞计数（J-L）。数据代表相应AOI的平均值和标准偏差。

图5.细胞接种PLLA纳米纤维支架体外（A-C）和体内（D-G）的骨诱导能力。在生长和骨诱导条件下，在DMEM培养基中培养22天的含有400000个细胞的PLLA纳米纤维支架（每个时间点和条件下3个支架）。使用石蜡包埋组织切片（A，B生长；C骨诱导条件）的Von Kossa染色，在5个感兴趣区域测定体外骨诱导能力。通过对无细胞（E）或含细胞（F）支架的Masson Goldner染色（D）以及OC的免疫组织化学染色（G），测定了16个缺损（细胞接种组）的48个感兴趣区域或10个缺损（对照组）的30个感兴趣区域中的体内骨形成。数据代表相应AOI的平均值和标准偏差。

图6.使用静电纺丝和电喷涂相结合，掺入PLLA-胶原蛋白混合纳米纤维支架的细胞在体外（A-F）和体内（G-L）的生长和存活。将约70万至200万个细胞掺入PLLA纳米纤维支架中，并在DMEM培养基中于生长（3个支架）和骨诱导性（3个支架）条件下培养22天，并使用MTT法分析代谢活性（a）。使用5个伊红染色的感兴趣区域分析细胞密度/分布，其中每个区域和时间点（B生长；C骨诱导条件）由3个石蜡包埋的支架组成。使用荧光TUNEL法测定在每个时间点和条件的3个石蜡包埋支架的至少3个组织切片中的细胞凋亡（D-F）。对从16个缺损获得的48个切片（细胞接种组）或从10个缺损获得的30个切片（对照组）进行体内分析。通过HE染色的石蜡切片（H，I）中的总细胞数（G）测定支架内的细胞密度，使用荧光TUNEL法测定石蜡包埋的组织切片中的细胞凋亡，并进行总细胞计数和阳性细胞计数（J-L）。数据代表相应AOI的平均值和标准偏差。

图7.细胞接种PLLA-胶原蛋白混合纳米纤维支架的体外（A-C）和体内（D-G）骨诱导能力。在生长和骨诱导条件下，在DMEM培养基中培养含400000个细胞的PLLA纳米纤维支架长达22天（每个时间点和条件下3个支架）。使用石蜡包埋的组织切片（A，B生长；C骨诱导条件）的Von Kossa染色，在5个感兴趣的区域测定体外骨诱导能力。通过对无细胞（E）或含细胞（F）支架的Masson Goldner染色（D）以及OC的免疫组织化学染色（G），测定了16个缺损（细胞接种组）的48个感兴趣区域或10个缺损（对照组）的30个感兴趣区域中的体内骨形成。数据代表相应AOI的平均值和标准偏差。