DOI:10.1016/j.polymer.2020.122606

体积肌肉缺失（VML）使骨骼肌的天然再生能力不堪重负，并且几乎没有有效的方法来恢复失去的肌肉质量和功能。构建旨在促进神经肌肉再生的组织工程肌肉是一种有前途的治疗途径。迄今为止，还没有研发出结合了促进神经肌肉再生药物的工程化肌肉构建体用于VML治疗。在此，研究者采用硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，即聚集蛋白，对本身具有促进肌肉再生潜力的电纺纤维蛋白微纤维束进行修饰，以刺激VML后的神经支配。用可溶性或化学栓系聚集蛋白在微纤维束上培养的成肌细胞显示乙酰基胆碱受体（AChR）的聚集显著增加，可溶性聚集蛋白在整个肌纤维束中均显示AChR簇，而栓系聚集蛋白仅在距基底表面10 µm处显示AChR簇。植入小鼠VML缺损4周后，与不含聚集蛋白的对照相比，用可溶性或栓系聚集蛋白预处理的构建体导致缺损部位出现显著增加的神经肌肉接头、肌纤维再生、血管浸润、神经浸润以及核yes-相关蛋白（YAP）表达。与含可溶性聚集蛋白的构建体相比，在植入后4周内，栓系聚集蛋白微纤维束在再生位点内提供了持续的聚集蛋白信号传导，并且进一步增加了再生组织中再生肌纤维的密度，具有统计学意义。这些数据显示了预处理的工程肌肉构建体的神经肌肉再生潜力，以在VML再生部位实现由局部递送的聚集蛋白诱导AChR聚集。

图1.可溶性和栓系聚集蛋白增加了乙酰胆碱受体的聚集，并在3D肌肉结构中产生了空间效应。A）示意图，显示了在电纺纤维蛋白微纤维束上的聚集蛋白系留和细胞接种。B）细胞接种支架横截面的Masson三色染色，表明栓系聚集蛋白支架的交联密度不同。C）在所有组中，对齐的肌管对肌球蛋白重链呈阳性（MHC，绿色），这表明在聚集蛋白治疗组中AChR簇对α-银环蛇毒素（αBTX，红色）呈阳性。D）在聚集蛋白治疗组中，AChR簇的密度显著增加。E，F）在聚集蛋白治疗组中单个AChR簇的面积和长度显著高于不含聚集蛋白构建体中的簇。G）MHC和αBTX免疫组化染色的细胞接种栓系聚集蛋白支架的横截面，表明了AChR簇在支架表面的空间位置。H）各组之间AChR簇的空间位置存在显著性差异：栓系聚集蛋白诱导的AChR簇靠近支架表面，而可溶性聚集蛋白诱导的AChR簇则与距支架表面的距离无关。*：p<0.05；***：p<0.001

图2.在无聚集蛋白和聚集蛋白治疗组中，VML缺损后的肌肉功能得到了同样的改善。A）支架植入时和植入后4周，无聚集蛋白、可溶性和栓系聚集蛋白构建体的总体形态。B）Masson三色染色的胫骨前肌横截面，两组之间的缺损区域（黄色虚线）和形态不同。C，D）各组之间收集的TA重量和横截面缺损尺寸存在差异。E，F）在治疗组之间没有观察到肌肉功能的差异。绿线：年龄匹配的未损伤TA肌肉的平均最大扭矩；红线：受伤后4周未治疗的VML缺损的平均最大扭矩。**：p<0.01；***：p<0.001

图3.用可溶性和栓系聚集蛋白构建体进行VML治疗会增加体内NMJ的形成。A）移植肌的横截面染色，其中有肌球蛋白重链（MHC，绿色）、神经丝（β3T，青色）和乙酰胆碱受体（αBTX，红色），缺损区域内肌管阳性区域密集且存在NMJs（白色虚线）。B）与其他治疗组相比，栓系聚集蛋白构建体导致缺损区域内的总肌纤维面积更大。C）栓系聚集蛋白构建体在缺损区域的神经总面积比其他治疗组更多。D）可溶性和栓系聚集蛋白构建体导致NMJ中AChR簇百分比高于无聚集蛋白的对照组。*：p<0.05；**：p<0.01

图4.与宿主肌肉相比，在植入的栓系聚集蛋白构建体内和周围，肌肉干细胞、血管和神经蛋白上调。A）用栓系聚集蛋白构建体处理的TA横截面的低倍放大图像，并对（i）Pax7（红色）、CD31（绿色）和β3-微管蛋白（青色）、（ii）仅CD31或（iii）仅β3-微管蛋白进行免疫组化染色。虚线：缺损区域；实线：未降解的支架区域。插图：三个具有相应高倍放大图像的区域，显示宿主肌肉（蓝色插图）、宿主缺损边界（红色插图）以及缺损区域内但在植入的支架之间（绿色插图）蛋白质表达的变化。B）高倍放大的宿主肌肉图像，Pax7、CD31和β3T染色水平较低。C）缺损区域内宿主肌肉与植入的栓系聚集蛋白支架之间边界的高倍放大图像。缺损区域内可见Pax7、CD31和β3T表达增加。D）在缺损区域内但在植入支架之间的高倍放大图像。支架之间的Pax7和CD31仍在上调，但β3T表达降低。

图5.栓系聚集蛋白增加了VML缺损中肌纤维、血管和卫星细胞的再生。A）通过胚胎肌球蛋白（eMHC，红色）和血管（CD31，绿色）的免疫染色可以看出各组之间缺损位点（白色虚线）内的表达差异。插图：高倍率图像。B）卫星细胞（Pax7，绿色）和丝状肌动蛋白（F-肌动蛋白，红色）的免疫染色显示治疗组之间卫星细胞募集的差异。C）用栓系聚集蛋白处理的缺损比零或可溶性聚集蛋白基团包含更多的核。D）栓系聚集蛋白导致缺损区域内的胚胎肌球蛋白阳性面积明显高于零或可溶性聚集蛋白。E）所有治疗组之间的总血管覆盖率存在显著性差异，其中栓系聚集蛋白诱导的缺损部位内CD31区域数量最多。F）栓系聚集蛋白构建体在缺损区域内的Pax7面积比零或可溶性聚集蛋白高。*：p<0.05；***：p<0.001