DOI:10.1016/j.colsurfb.2020.111124

本研究已从节肢动物（Ap）转录组中鉴定出转谷氨酰胺酶（TG）的抗氧化功能。从转谷氨酰胺酶核心结构域中预测出抗氧化肽ML11（MLRSIGIPARL），并评估了该肽的自由基清除能力，结果表明其以剂量依赖性的方式发挥作用。在人血白细胞中分析了ML11肽的细胞毒性，在任何细胞群中均未产生细胞毒性。此外，通过静电纺丝技术制备了包封抗氧化肽ML11的纳米纤维毡。与壳聚糖聚乙烯醇共混垫相比，包封抗氧化肽ML11的纤维垫显示出纤维直径有所增加。通过X射线衍射法测定了壳聚糖和聚乙烯醇聚合物在20～30℃（2θ°）的宽频带上结晶行为向非晶态的变化。FTIR表明了聚合物中存在的官能团以及壳聚糖（CS）和聚乙烯醇（PVA）的组分之间的相互作用。流式细胞术和荧光显微镜证实，纤维通过清除细胞内ROS而包裹肽，从而保持抗氧化活性。包封ML11肽的垫在NIH-3T3小鼠胚胎成纤维细胞中未显示细胞毒性。同样，包封ML11肽的纤维在NIH-3T3细胞中显示出潜在的伤口愈合活性。总而言之，该研究表明具有伤口愈合潜力的包封ML11肽的纳米纤维垫可用作生物药物。

图1.H2O2处理后ApTG的基因表达谱。通过qRT-PCR在不同时间（0、5、10、15和20天）测量过氧化氢激发后转谷氨酰胺酶在高原梭菌中的调控表达。在治疗后第15天（点），发现ApTG mRNA的表达升高，并且在治疗后第20天观察到表达的降低。星号（*）表示在GraphPad棱镜（8.0.2版）中通过双向ANOVA和Sidak检验得出的对照（第0天）与处理（第5、10、15和20天）之间的显著性差异。

图2.ML11肽的抗氧化活性。（A）与Trolox的DPPH自由基清除能力相比，ML11肽具有显著的DPPH自由基猝灭活性。（B）TEAC分析显示ML11在清除ABTS自由基方面具有剂量依赖性trolox等效容量。（C）HRSA分析显示ML11抑制羟基自由基的能力。（D）将ML11的超氧化物自由基清除活性与Trolox进行了比较，其中ML11的自由基清除活性优于Trolox。所有测试均一式三份进行，其值用平均值±标准差（n=3）表示。星号（*）表示阳性对照组（Trolox）与在GraphPad棱镜（8.0.2版）中通过双向ANOVA和Sidak检验测得的处理组之间的显著性差异。

图3.ML11肽对人PBMCs的细胞内ROS淬灭活性。通过荧光探针DCFDA使用FACS评估PBMCs中的细胞内ROS水平：（A）暴露于2 mM H2O2后的血糖谱；（B）由于细胞内ROS水平升高引起的DCFDA荧光位移；（C）由于PBMCs中ROS水平升高，直方图显示在暴露于2 mM H2O2时强烈的荧光峰移动；（D）用H2O2（2mM）和ML11肽处理后的血液分布。（E）由于ML11肽ROS清除活性引起的荧光变化；（F）直方图显示由于低白细胞ROS而没有荧光峰移动。数据表示为平均±SD（n=3）。荧光成像揭示了通过荧光显微镜捕获的细胞内ROS的水平：（G）暗场图像显示了用H2O2处理的白细胞中ROS-DCFDA复合物的荧光；（H）显示实际细胞的明场图像；（I）经ML11处理的肽细胞中细胞内ROS水平降低的暗场图像；（J）显示实际细胞的明场图像。光学显微图像（G，H，I和J）的比例尺为20 µm。

图4.ML11对人血白细胞的细胞毒性。当存在或不存在100μM ML11肽时，针对血液白细胞评估ML11细胞毒性。对于阳性和阴性对照，分别使用Triton X-100和PBS。在血白细胞中，ML11肽未显示任何明显的细胞毒性。数据表示为平均值±SD（n=3）。星号（*）表示在GraphPad棱镜（8.0.2版）中通过双向方差分析和Sidak检验，阳性对照组（Triton X-100）与治疗组（100 µM）之间存在显著性差异。

图5.包封ML11的CS-PVA毡的FE-SEM分析。（A）CS-PVA 1:3；（B）CS-PVA 1.5:3；（C）CS-PVA 2:3，显示随机排列且无珠的结构纤维；（D）包封ML11肽的CS-PVA垫；（E）1:3 CS-PVA的纤维直径分布；（F）1.5:3 CS-PVA的纤维直径分布；（G）2:3 CS-PVA的纤维直径分布；（H）包封ML11的CS-PVA（1.5:3）垫的纤维直径。

图6.包封ML 11肽的CS-PVA垫对降低ROS的作用。采用流式细胞仪（FACS）分析DCFDA染料对人血白细胞氧化应激的降低作用。（A）直方图描绘了荧光的变化，证实了过氧化氢处理的白细胞样品中氧化应激水平的增加。（B）直方图图像显示了荧光强度的降低，证实了CS-PVA毡处理的白细胞中的氧化应激浓度水平降低。（C）直方图显示荧光强度没有变化，这证实了肽处理的白细胞样品中氧化应激的降低程度更大。所有数据均以平均值±SD表示，n=3。共聚焦显微镜研究表明白细胞的细胞内氧化应激降低。（D）暗场图像通过荧光强度说明了过氧化氢处理的白细胞中氧化应激的存在，而明场图像显示白细胞。（E）暗场图像显示了CS-PVA对照垫处理的细胞中荧光强度的轻微降，而明场图像显示白细胞。（F）暗场图像显示无荧光强度，这证实了CS-PVA-ML11垫处理的细胞中氧化应激降低，而明场图像显示白细胞。所有数据均以平均值±SD表示，n=3。

图7.包封ML11的CS-PVA垫对NIH-3T3细胞的影响。使用处理过的和未处理过的ML11肽在小鼠成纤维细胞中评估NIH-3T3细胞的增殖和迁移；（A）包封ML11的CS-PVA垫的细胞毒性作用决定了细胞的活力和细胞的增殖。针对包封ML11的CS-PVA垫测定了NIH-3T3的细胞活力。磷酸盐缓冲液用作对照，包封ML11肽的CS-PVA垫对NIH-3T3细胞无细胞毒性作用。星号（*）表示对照组与处理组在统计学上有所不同。数据表示为平均值和标准偏差，其中n=3，p≤0.05。（B）观察细胞在第0 h单层损伤后的增殖和迁移情况。（C）在24 h用ML11肽处理的垫显示13.79％的封闭活性。（D）在48 h用肽处理的垫显示出72.41％的伤口封闭活性。（E）肽处理的细胞在72 h表现出98.62％的封闭活性。光学显微图像（B，C，D和E）的比例尺为20 µm。