DOI: 10.1039/C9BM01990A

腺苷及其受体已成为控制骨愈合细胞功能的替代靶点。然而，由于腺苷在体内的快速降解，其可溶性递送并没有被证明是有效的。因此，研究者通过聚多巴胺化学性质设计了一种稳定的生物材料表面腺苷涂层，以通过A2bR信号控制成骨和破骨细胞生成。首先，研究者制备了电纺聚乳酸（PLLA）纳米纤维片材，并通过一步腺苷-聚多巴胺涂层工艺对其进行改性。扫描电子显微镜（SEM）显示，与仅聚多巴胺的片材相比，在腺苷-聚多巴胺涂覆的PLLA（AP-PL）片材上有颗粒沉积。此外，X射线光电子能谱分析证实了腺苷引起氮信号的增加。此外，与仅聚多巴胺的片材相比，AP-PL片材的腺苷负载效率和保留率显著提高。在AP-PL上培养的人脂肪干细胞（hADSCs）表达的A2bR（1.30±0.19倍）明显高于在仅聚多巴胺片材上培养的水平。这反过来显著提高了生长培养基中生长的细胞在14天和21天的Runx2（16.94±1.68和51.69±0.07倍）、OPN（1.63±0.16和30.56±0.25倍）、OCN（1.16±0.13和5.23±0.16倍）和OSX（10.01±0.81）的表达。同样，AP-PL组的矿物质沉积比聚多巴胺组的增强程度更大，而A2bR的阻断则显著下调了成骨作用。最后，AP-PL片上的生长显著抑制了RAW 264.7细胞的破骨细胞分化。但是，阻断A2bR后破骨细胞分化得到明显促进。综上所述，聚多巴胺辅助腺苷一步涂层是一种可行的生物材料表面修饰方法，以控制干细胞的成骨分化和骨愈合。

图1.在PLLA（PL）纳米纤维上一步涂覆腺苷（1 mg/ml）聚多巴胺（2mg/ml）的示意图以及诱导腺苷2b受体（A2bR）信号的示意图。

图2.a）PL、腺苷涂层的PL（A-PL）、聚多巴胺涂层的PL（P-PL）和一步涂覆腺苷聚多巴胺的PL（AP-PL）纳米纤维片的SEM显微照片；b）纳米纤维的水接触角（n=4）； c）纳米纤维的微型BCA分析（n=4）。使用单向方差分析，分别与PL和A-PL相比，*和†P<0.05。

图3.通过XPS评估的PL、A-PL、P-PL和AP-PL的表面化学成分：a）宽扫描；b）氮（N1s）光谱；c）高分辨率碳（C1s）光谱。

图4.a）估计A-PL和AP-PL中的腺苷涂层效率（n=4）（使用学生t检验，*P<0.05），b）A-PL和P-PL中腺苷的分离曲线。

图5.纳米纤维对细胞粘附、增殖和A2bR表达的影响的评估：a）第7天在P-PL和AP-PL上培养的hADSCs的F-肌动蛋白染色；b）在PL、A-PL、P PL和AP-PL上培养的hADSCs的DNA分析（n=4，使用双向方差分析，*P<0.05）；c）第14天在P-PL和AP-PL上培养的hADSCs的A2bR染色；d）第14天hADSCs中A2bR基因的相对表达，每组（n=4）用其管家基因GAPDH标准化，然后将所有组在生长培养基（GM）中标准化为P-PL。通过单向方差分析评估统计学差异，表明分别与GM、A-PL和AP-PL中的P-PL相比，†、‡和§P<0.05。

图6.成骨标志物在纳米纤维上培养的hADSCs中的表达：在生长培养基（GM）和成骨培养基（OM）中第14天的a）Runx2、b）OPN、c）OCN、d）OSX和第21天的e）Runx2、f）OPN、g）OCN、h）OSX（n=4，单向方差分析其显著性，与P-PL、A-PL和AP-PL相比，表示为†、‡和§P<0.05）。

图7.矿物沉积分析：a）第14天和第21天，P-PL、A-PL、AP-PL和P-PL（OM）的茜素红S染色（n=4）；在b）第14天和c）第21天进行钙分析（使用单向方差分析，分别与P-PL、A-PL和AP-PL相比，†、‡和§P<0.05）。d）在第21天进行矿物沉积的SEM分析以及hADSC培养21天后，在e）GM的P-PL、f）GM的AP-PL和g）OM纳米纤维的P-PL中进行矿物沉积的XPS分析。

图8.第14天，PSB 603处理对a）Runx2、b）OPN和c）OSX相对表达水平的影响（n=4，使用单向方差分析，†P<0.05）。d）P-PL、AP-PL和P-PL（OM）中用/不用PSB 603处理的Runx2和OPN标志物的免疫荧光染色（比例尺=200 µm）。

图9.a）在P-PL和AP-PL纳米纤维上培养的RAW 264.7细胞中，F-肌动蛋白和A2bR受体的免疫染色。b）在P-PL和AP-PL纳米纤维上的RAW 264.7细胞中A2bR的相对表达水平（n=4，使用学生t检验，*P<0.05）。c）在P-PL和AP-PL上培养的RAW 264.7细胞的TRAP分析（n=4，使用单向方差分析，*P<0.05）。d）TRAP、e）RANKL、f）NFATc1和g）CTSK的相对表达水平（n=4，使用单向方差分析，*P<0.05），h）IL-10和i）TNF-α在培养于纳米纤维上的RAW 264.7细胞中的相对表达水平（n=4，使用学生t检验，*P<0.05）。

图10.PSB 603对a）TRAP、b）RANKL、c）NFATC1、d）CTSK、e）IL-10和f）TNF-α表达的影响（n=4，使用单向方差分析，*P<0.05）。g）A2bR信号控制成骨细胞分化的示意图。