DOI:10.1016/j.apsusc.2020.146311

为了改善骨骼生长、模仿天然细胞外基质持续释放多重生长因子的功能，采用静电纺丝法制备了多孔明胶纳米纤维支架，使用模拟体液溶液涂覆羟基磷灰石，并用抗生物素蛋白进行表面功能化以促进与生物素化生长因子的结合，即骨形态发生蛋白2（BMP-2）和成纤维细胞生长因子2（FGF-2）的比例不同。使用扫描电子显微镜进行结构表征，并进行傅立叶变换红外光谱和钙测定以评估钙的组成。免疫染色技术证实了多重生长因子的结合。使用定量聚合酶链反应分析研究了两种生长因子和羟基磷灰石对成骨细胞分化的影响。通过控制FGF-2/BMP-2比率，多重生长因子成功地缀合到功能化表面上。因子释放曲线与物理吸附曲线的比较表明，抗生物素蛋白-生物素结合对于持续释放更有效。骨再生通过多重生长因子传递与羟基磷灰石纳米纤维涂层之间的协同作用而得以增强，成骨基因标志物的表达增加证实了这一点。因此，纳米纤维为骨组织工程提供了一种有希望的具有多重生长因子控释的骨传导性支架材料。

图1.用于骨组织再生的FGF-2/BMP-2-固定羟基磷灰石/明胶纳米纤维支架的制备过程示意图。

图2.（a，b）明胶纳米纤维的SEM图像；通过cSBF处理的G，（c，d）羟基磷灰石/明胶纳米纤维；经mSBF处理的cH-G（e，f）；mH-G方法，每种情况下钙含量的图形量化（右）。****=P<0.0001。图（b，d，f）高倍率SEM图像。a，c，e中的比例尺代表20 µm，b，d，f中的比例尺代表10 µm。

图3.用cSBF和mSBF溶液处理过的明胶纳米纤维和羟基磷灰石/明胶纳米纤维的溶胀度（a）和降解率（b-c）图。

图4.含生长因子的免疫染色的荧光显微镜图像。（a）和（c）不含任何生长因子的纯明胶纳米纤维。（b）和（d）FGF-2和BMP-2以1:1比例固定的纳米纤维。纳米纤维上的FGF-2用红色（a）和（b）表示，纳米纤维上的BMP-2用绿色（c）和（d）表示。放大倍数为10倍。

图5.用FGF-2:BMP-2（1:1比值）标记明胶纳米纤维抗体的FGF-2和BMP-2的荧光强度表示为G11，用cSBF和mSBF方法，FGF-2:BMP-2（1:1比值）标记的羟基磷灰石/明胶纳米纤维的荧光强度分别表示为cH-G11和mH-G11。进行统计分析以与对照组（G）比较。（**=P<0.01，*=P<0.05）。

图6.细胞培养1、3、5和7天（以2,000个细胞/孔播种）后，明胶纳米纤维上hASC的CCK-8结果。所有条件均使用纳米纤维（对照组为纯纳米纤维）进行。 （a）按羟基磷灰石的材料和结构比较。（b）按生长因子比较不同种类的结构。进行统计分析以与对照组比较（G代表（a），FGF代表（b））。（*=P<0.01，***=P<0.001，****=P<0.0001）。

图7.hASC培养物在明胶纳米纤维（G）和羟基磷灰石/明胶纳米纤维（cH-G和mH-G）上的成骨基因表达。进行统计分析以与对照组（G）比较。（*=P<0.05，**=P<0.001）。

图8.在生长因子固定的不同条件下（FGF-2:BMP-2=1:0、1:1和0:1分别显示为cH-G10、cH-G11和cH-G01），hASCs在羟基磷灰石/明胶纳米纤维（cH-G）上的RunX2、COL1α1和OCN基因表达。进行统计分析以与对照组（BMP）比较。（***= P<0.001，****=P<0.0001）。

图9.在生长因子固定的不同条件下（FGF-2:BMP-2=1:0、1:1和0:1分别显示为mH-G10、mH-G11和mH-G01），hASCs在羟基磷灰石/明胶纳米纤维（mH-G）上的RunX2、COL1α1和OCN基因表达。进行统计分析以与对照组（BMP）比较。 （***=P<0.001，****=P<0.0001）。

图10.在有无生长因子固定的不同条件下（FGF-2:BMP-2=1:0、1:1和0:1），hASCs在明胶纳米纤维（G）和羟基磷灰石/明胶纳米纤维（mH-G，cH-G）上的碱性磷酸酶活性。进行统计分析以与对照组（G）进行比较。所有样品条件下的活性均显著高于对照组，P<0.05。

图S1.明胶纳米纤维的尺寸分布（直径）：（a）明胶纳米纤维，和（b，c）用cSBF和mSBF溶液处理过的羟基磷灰石/明胶纳米纤维。

图S2.（a）明胶纳米纤维和（b，c）羟基磷灰石/明胶纳米纤维，（b）cH-G和（c）mH-G的FT-IR光谱。

图S3.在明胶纳米纤维上培养的人脂肪干细胞的活/死分析的荧光图像：（a）呈现培养皿中的细胞，（b）呈现G，（c）呈现cH-G，（d）呈现mH-G。比例尺：200 µm。

图S4.在明胶纳米纤维上培养的人脂肪干细胞的4'，6-二氨基-2-苯基吲哚/若丹明染色的荧光图像：（a）呈现培养皿中的细胞，（b）呈现G，（c）呈现cH-G，以及（d）呈现mH-G。比例尺：200 µm。

图S5.在纯、cH-G和mH-G条件下，在明胶纳米纤维上培养的人脂肪干细胞的活/死分析荧光图像。比例尺：200 µm。

图S6.细胞培养7天后（明胶以2,000个细胞/孔播种），明胶纳米纤维上的hASCs的CCK-8结果。显示了含生长因子（FGF-2和BMP-2比例为1:1）的纳米纤维与不含生长因子的纳米纤维的比较。使用无生长因子的样品作为对照组进行统计分析。（**=P<0.01，*=P<0.05）。

图S7.从明胶纳米纤维和羟基磷灰石/明胶纳米纤维中累积释放FGF-2生长因子。 GA表示具有吸附的生长因子的纯纳米纤维。G、cH-G和mH-G表示纯纳米纤维，通过cSBF方法生产的羟基磷灰石/明胶纳米纤维，以及用mSBF法生产的羟基磷灰石/明胶纳米纤维，其中生长因子用抗生物素蛋白-生物素复合物结合。缩写后的数字表示FGF-2和BMP-2的含量，单位为ng ml-1。假定生长因子负载量在100%结合时有效。

图S8.用不同浓度的生长因子标记的抗体的荧光显微镜图像。（a）和（e）没有任何生长因子的纯明胶纳米纤维。FGF-2与BMP-2的比例为1:0（b，f）、1:1（c，g）和0:1（d，h）。纳米纤维上的FGF-2用红色（a-d）表示，纳米纤维上的BMP-2用绿色（e-h）表示。放大倍数为10倍。