DOI:10.1021/acsami.9b22596

阻碍体外骨关节炎研究转化为临床疾病缓解疗法的一个主要限制因素是软骨细胞在标准单层条件下会迅速扩散和去分化。目前在培养过程中保持软骨细胞圆形形态的策略要么非自然地限制了粘附，要么将软骨细胞置于过硬的机械环境中，或在许多应用中不可行。为了解决当前技术的局限性，研究者开发了一种独特的复合薄膜细胞培养平台CellWell，用于模拟关节软骨，该平台利用微图案化的半球形孔，精确地测量单个细胞（直径12-18μm）的大小，促进生理上的球形软骨细胞形态，同时保持与标准细胞培养和分析技术的兼容性。采用电纺聚乙烯醇（PVA）纳米纤维包埋15μm厚的5%琼脂糖纤维构建CellWells。透射电子显微镜（TEM）显示PVA纳米纤维的平均直径为60.9±24 nm，与观察到的人类脚踝II型胶原纤维的平均直径53.8±29 nm非常吻合。利用AFM纳米压痕技术，在15μm/s压痕下，CellWells的压缩模量为158±0.60 kPa，与天然细胞周基质的硬度值非常吻合。将取自踝关节软骨的原代人类关节软骨细胞接种到CellWells中，并于24小时进行评估。软骨细胞在CellWells中保持其圆形形态（平均长宽比为0.87±0.1，相对于三维（3D）对照[0.86±0.1]）比在标准条件下（0.65±0.3）接种的效果更为有效，平均存活率大于85%。CellWell的设计，在具有生理硬度的薄膜基质中存在开放的半球形孔，将二维（2D）培养系统的实际优势与三维系统的生理优势结合在一起。通过其易用性和维持软骨细胞生理形态的能力，期望CellWell将提高未来利用该培养平台进行研究的临床转化性。

图1.软骨细胞形态影响内部结构。使用标准2D细胞培养技术将小鼠股骨头髋关节外植体（A）和原代人类关节软骨细胞（B）（C）镀在纤维粘连蛋白（FN）涂层的盖玻片上，用4%多聚甲醛固定，并用ActinRed 555 Ready探针试剂染色 （ThermoFisher），在GE DeltaScan OMX SR显微镜上使用3D结构照明显微镜（3D-SIM）以超高分辨率成像。 显示了体积图像堆栈的最大强度投影。请注意，在（A）的侧视图中，组织的浑浊阻止了外植体图像中除最表面结构以外的所有结构的成像，这是自然组织和3D细胞培养物成像中的常见问题。比例尺为2μm，适用于顶部和侧面投影。

图2.CellWell设计示意图。（A）光掩模设计的代表性部分。单位为μm。（B）沿（A）中的虚线的CellWell的截面图。

图3.AFM实验设计示意图。（A）纳米压痕阶段。（B）应力松弛阶段。

图4.软骨细胞直径分布。（A）原代人类关节软骨细胞在悬浮液中的平均直径为14.6±2.1μm（SD），每个供体的平均直径约为11至19μm。（B）细胞计数屏幕显示了一个具有代表性的单供体软骨细胞直径分布。

图5.微图案化孔与软骨细胞直径匹配。（A）用于创建CellWells的光刻图案的扫描电子显微镜（SEM）图像。（B）CellWell的相衬图像，具有三种尺寸的孔，孔尺寸精确到适合单个关节软骨细胞的大小；比例尺10μm。（C）单个孔的光学轮廓测定横截面轮廓（平均值±标准偏差，n=10个孔）。（D）CellWell的宏观外观；比例尺5 mm。

图6.CellWell琼脂糖和踝关节软骨的机械特性。（A）琼脂糖CellWells的平均纳米压痕曲线。（B）琼脂糖CellWells和关节软骨的平均应力松弛。（C）关节软骨的平均纳米压痕曲线。（D）不同应变率下琼脂糖CellWells上的平均纳米压痕。

图7.用视频光谱比较仪测量CellWells的透光率，证实了CellWells的透光性。

图8.FTIR光谱证实了PCM蛋白在CellWells上的成功涂覆。

图9.电纺PVA纳米纤维的直径分布代表了踝关节软骨中的II型胶原纤维。 （A）交联后的PVA纳米纤维和（B）从脚踝提取的II型胶原纤维的TEM图像；比例尺1μm。（C）交联的PVA纳米纤维的分布，以概括用于分离软骨细胞培养的CellWell关节软骨模型中关节软骨细胞外基质II型胶原纤维的性质。纤维测量值是从n=3个独立样本中获得的，各个测量值均显示在图表上。

图10.软骨细胞的活力在CellWell中得以维持。使用标准倒置荧光显微镜在24 h观察到软骨细胞活力为85.6±10.5%（SD）。细胞可渗透NucBlue染色所有细胞核（以绿色显示），而细胞不渗透NucGreen仅染色膜被破坏的（死）细胞的细胞核（以品红色显示；死细胞在重叠图像中显示为白色）。比例尺50μm。

图11.CellWells促进生理性软骨细胞形态的维持。（A）在24小时使用不同平台接种的软骨细胞的相衬图像显示在n=3个供体的每个平台上接种的软骨细胞的长宽比分布。在3D琼脂糖和CellWell软骨细胞形态之间未观察到差异，这表明CellWell维持了生理形态，而所有其他样品在Kruskal-Wallis和Dunn的事后多重比较检验的基础上均存在显著性差异（p≤0.0002）。比例尺50μm。

图12.聚多巴胺功能化可促进CellWell中软骨细胞形态维持28天。（A）在CellWell中接种4周的软骨细胞的相衬图像显示出典型球形形态的稳固维持；蓝色箭头：软骨细胞；红色箭头：PDA聚集的大小颗粒；比例尺50μm。（B）PDA功能化CellWell的宏观外观显示琼脂糖明显变黑。（C）在4周的时间内进行的宽高比测量（平均值±标准偏差，n=150个细胞）显示CellWell能够长期保持球体形态（基于Kruskal-Wallis测试和Dunn的多重比较事后分析，相对于每个时间点的二维盖玻片，p＜0.0001）。