DOI: 10.1021/acsami.9b21683

伤口愈合延迟和住院时间延长通常与急性和慢性伤口的细菌定植相关。多重耐药菌的增多以及局部抗菌药物的生物相容性差，确保了抗微生物剂的安全性和疗效。在不干扰哺乳动物细胞增殖和迁移的情况下，靶向微生物膜的抗微生物剂在创伤治疗中具有广阔的前景。本文报道了一种超亲水性电纺明胶纳米纤维敷料（NFDs）的用途，该敷料包含广谱抗微生物聚合物ε-聚赖氨酸（εPL），可通过聚多巴胺（pDA）交联来治疗二级烧伤。在部分厚度烧伤的猪模型中，与未经治疗的烧伤相比，NFDs促进了伤口闭合，减少了增生性瘢痕。对与烧伤接触的NFDs的分析表明，敷料能捕获早期定植细菌并激发杀菌活性，从而为成纤维细胞迁移和再上皮化创造一个无菌的伤口床。为支持这些观察结果，在铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌定植的部分厚度烧伤的猪模型中，NFDs降低了细菌生物负载，促进了伤口闭合和再上皮化。NFDs的临床疗效优于标准银敷料。新开发的敷料在临床前模型中具有优异的生物相容性和抗菌效果，这也证明了其在不影响组织再生的情况下用于处理感染伤口的临床应用潜力。

图1.εPL的抗菌特性。（A）热图显示εPL对多种抗生素敏感性/耐药性微生物的最小抑菌浓度（MIC）分布。热图中的每一行表示单个物种中的不同菌株。（B）Sytox green（SG）分析，显示了用εPL（16μg/mL）处理细菌细胞后不可透过膜的染料的吸收。（C）在细菌生长20天后，用尚不致命浓度的庆大霉素，加替沙星和εPL繁殖的铜绿假单胞菌（ATCC 9027）MIC的倍数变化。（D）用不同浓度εPL处理的铜绿假单胞菌O1生物膜中细胞活力的定量。（E）暴露于不同浓度εPL后，PA O1生物膜的共聚焦显微镜活/死细胞图像。比例尺=10μm。

图2.共聚焦图像证实了εPL在预防铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌感染对宿主细胞的不利影响方面的能力。（A）未处理的hDFs（未感染），显示完整的细胞骨架和核形态；（B）感染金黄色葡萄球菌菌株的hDFs（感染复数，MOI=25）显示出变形的细胞形态。请注意，肌动蛋白丝附近存在大量金黄色葡萄球菌（绿色信号）。（C）在预防模式下（即在微生物感染之前）和（D）回归模式下（即在宿主细胞感染后2小时）的εPL的作用。（E）感染PAO1_gfp株的hDFs（感染复数，MOI=25）。（F）和（G）εPL在预防和回归模式中的作用。注意在两种情况下都没有任何绿色信号（由于PAO1_gfp），表明该聚合物具有强大的抗菌活性。对于所有实验，εPL的终浓度为1 mg/mL。比例尺=10 µm。

图3.在刮伤试验中，εPL对各种条件下hDFs细胞迁移的影响。（A）照片显示εPL（1 mg/mL）在两个不同时间点对hDFs迁移的影响。（B）与未处理或存在成纤维细胞生长因子的细胞迁移相比，εPL浓度取决于时间的变化。（C）εPL消除了从金黄色葡萄球菌ATCC 29213菌株中收集的细菌分泌体的抑制作用。在25％（v/v）时，金黄色葡萄球菌分泌基因组抑制了细胞迁移，而εPL（1 mg/mL）的掺入挽救了hDFs的迁移。（D）显示RWC值随时间变化的图，所有结果均为2个独立重复实验的平均值。

图4.含有εPL的纳米纤维敷料的抗菌特性。（A）用聚多巴胺交联的εPL负载明胶纳米纤维的扫描电子显微镜（SEM）图像。（B-D）高分辨率N1s XPS扫描显示掺入纳米纤维敷料后εPL的化学状态。εPL_Gel_pDA敷料具有长期的抗菌活性。（E）MRSA 9808R和（F）铜绿假单胞菌ATCC 9027菌株。请注意，即使在PBS中浸泡35天后也没有任何细菌生长，这证明了敷料具有出色的耐久性。

图5.负载εPL的电纺纳米纤维垫的体外生物相容性。（A）HaCaT和（B）hDFs接种在含有εPL的电纺明胶纳米纤维上的细胞增殖测定。使用线性校准曲线将通过MTS分析获得的代谢活性转化为细胞数。总细胞数据分别来自盖玻片和测试组的三个独立的一式三份实验的平均值±标准偏差。代表性的共聚焦图像显示了接种在Gel_pDA和εPL_Gel_pDA纳米纤维垫上的（C）HaCaT细胞和（D）hDFs的形态。比例尺=20 µm。SEM图像显示了在εPL_Gel_pDA纳米纤维垫上接种后（E）4天和（F）7天时hDFs的形态。

图6.在局部厚度烧伤后，纳米纤维敷料对皮肤创面愈合的影响。（A）数字图像显示应用银和εPL_Gel_pDA敷料后伤口愈合的进展。敷料一周换两次。比例尺=1 cm。（B）根据平均Bates-Jensen评分（每组4个伤口）对伤口状况进行总体评估。银质敷料治疗的伤口在红色条中突出显示，而εPL_Gel_pDA敷料在蓝色条中突出显示。（C）通过对每次换药后拍摄的数码照片进行平面分析，确定伤口闭合度（平均值±标准偏差）。注：伤后第31天观察到经εPL_Gel_pDA敷料治疗的烧伤完全愈合，而银敷料为35天。（D）在第46天，对用抗菌敷料治疗的伤口的皮肤活检进行H&E和Masson三色染色。比例尺=100μm。（E）受伤后第7天从伤口处取出纳米纤维敷料的扫描电镜图像。注意纤维形态的丧失和表面变形的类球菌物种的存在。比例尺=1μm（F）。示意图显示了烧伤后纳米纤维敷料可能的作用机理。早期的定植者，如金黄色葡萄球菌或铜绿假单胞菌，迁移到伤口部位，被超亲水敷料吸收。聚合物优异的细胞选择性只会破坏细菌膜，从而形成有利于引导细胞迁移和通过产生胶原再上皮化的伤口床。

图7.纳米纤维敷料对铜绿假单胞菌感染烧伤创面愈合的影响。（A）数字图像显示了应用银和εPL_Gel_pDA敷料以及未经治疗的烧伤后伤口愈合的过程。每周更换两次敷料。比例尺=1 cm。（B）基于平均Bates-Jensen评分（每组n=5个伤口）对伤口状态的总体评估。用银敷料处理过的伤口在红色条中突出显示，而εPL_Gel_pDA敷料在蓝色条中突出显示。（C）通过每次换药后拍摄的数码照片的平面分析确定伤口闭合度（平均值±标准偏差）。通过Mann-Whitney检验，**p＜0.01。（D）用抗微生物敷料处理后的铜绿假单胞菌生物负载。在使用和不使用抗菌敷料的情况下，铜绿假单胞菌定植的局部厚度烧伤的组织学分析。（E）接种后第1天和第32天活检的苏木精和曙红（H＆E）染色。比例尺=100μm。（F）接种后各个时间点进行的活检的Masson三色（MT）染色。比例尺=100μm。

图8.纳米纤维敷料对金黄色葡萄球菌定植的烧伤后皮肤伤口愈合的影响。（A）数字图像显示了在应用银和εPL_Gel_pDA敷料后伤口愈合的过程。比例尺=1 cm。每周更换两次敷料。（B）基于平均Bates-Jensen评分（每组n=5个伤口）对伤口状态的总体评估。用银敷料处理过的伤口在红色条中突出显示，而εPL_Gel_pDA敷料在蓝色条中突出显示。（C）通过每次换药后拍摄的数码照片的平面分析确定伤口闭合度（平均值±标准偏差）。通过Mann-Whitney试验，**p <0.01。（D）用抗菌敷料处理后的金黄色葡萄球菌生物负载。（E）用εPL_Gel_pDA敷料和对照银敷料治疗后，金黄色葡萄球菌定植的伤口活检的H＆E染色。（F）用εPL_Gel_pDA敷料和对照银敷料治疗后，金黄色葡萄球菌定植的伤口活检的Masson三色染色。