DOI: 10.1002/adhm.201901850

渐进的抗生素耐药性是医疗卫生领域的一项严峻挑战，增加了皮肤伤口治疗的难度，因此迫切需要使用替代抗生素的抗菌创面敷料。越来越多的研究指出纤维素膜可作为伤口敷料，只是还需要进一步的功能化步骤。在本研究中，设计了一种结合抗菌肽（AMP）和纤维素结合肽（CBP）的双功能肽。AMPs通过多种作用方式影响细菌，从而降低选择抗生素耐药性的进化压力。双功能肽已成功地固定在细菌来源的纤维素膜或植物来源的纤维素的电纺纤维上，并严格控制肽浓度（0.2±0.1至4.6±1.6μg mm-2）。利用这一方法，开发了对金黄色葡萄球菌（log4减少）和铜绿假单胞菌（log1减少）具有抗菌活性的新材料。此外，膜在人成纤维细胞培养中具有细胞相容性。此外，还设计了一种细胞粘附剂CBP-RGD肽并将其固定在膜上，与原始纤维素相比，可使细胞扩散增加2.2倍。通用概念为不同来源和结构的纤维素膜的功能化提供了一个工具箱，并在肽方面有广泛的选择。缓冲盐溶液中的功能化避免了进一步的纯化步骤，从而可在伤口敷料领域之外进行转化研究和多种应用。

图1.不同纤维素来源和特性的膜的扫描电子显微镜（SEM）图像。a）醋酸纤维素/聚氨酯共混物（CAPU）的电纺纤维，以及b）纤维素/聚氨酯（CPU）脱乙酰化的电纺纤维。脱乙酰之前和之后获得的SEM图像均未显示纤维形态的任何差异。电纺纤维在亚微米范围内，平均直径为0.80±0.41 µm（n=200）。c）细菌纤维素（BC）显示的纤维平均直径为69±26 nm（n=150）。d）在所有膜上，测量水在空气中的接触角。数据表示为每个膜n=3次测量的平均值±标准偏差。在CPU膜上观察到完全润湿。

图2.用X射线光谱学（XPS）表征基底的化学表面成分。a）醋酸纤维素和脱乙酰纤维素的化学结构。b）细菌纤维素（BC）、醋酸纤维素（CA）、聚氨酯（PU）、5:95醋酸纤维素:聚氨酯（5％CAPU）、10:90醋酸纤维素:聚氨酯（10％CAPU）和脱去乙酰基的10:90纤维素:聚氨酯（CPU）的光谱图。插图：在400 eV处放大。 PUR和5％CAPU中存在氮，这是通过400 eV处的峰来体现的。c）i）BC、ii）10％CAPU和iii）脱乙酰化的10％CAPU的C 1s化学环境的高分辨光谱以及C-C、C-O、O-C-O和O-C=O的对应拟合。O-C=O峰用于监测电纺膜的脱乙酰作用。d）乙酰基的定量。在Na/MetOH中脱乙酰3小时后，观察到O-C=O的减少。数据表示为n=7（CAPU）或n=5（CPU）单个膜的平均值±标准偏差。在非参数Mann-Whitney检验中评估统计学显著性，*p<0.05。

图3.a）细菌纤维素膜（BC）上肽的定量。为了控制纤维素膜上表观的最终肽浓度，评估了不同的固定条件。选择了在其最终肽浓度上有显著差异的四种条件，以在细菌和哺乳动物细胞培养物中进行体外评估（红色标记）。数据表示为每种条件下n=4个膜的平均值±标准偏差。b）根据固定在细菌纤维素（BC）以及c）电纺纤维素：聚氨酯膜（CPU）上的条件，对纤维素基质上肽浓度的定量。在类似的固定参数下，可以将更多量的肽束缚到电纺膜上。绘制了本研究中使用的所有单个膜。水平线代表平均值。在非参数Kruskal-Wallis检验中评估统计学显著性，然后在Mann-Whitney检验中进行成对比较。除非用n.s.另作说明，否则（b）或（c）中条件之间的平均值存在显著性差异，p<0.05。

图4.AMP–CBP–FAM功能化膜的抗菌活性。通过再生试验确定响应于肽浓度的菌落形成单位（CFU）。在x轴上显示测得用于细菌培养的实际膜的平均肽浓度。a）金黄色葡萄球菌；条件之间的非显著性差异用n.s突出显示。所有其他条件之间显示统计学上的显著性差异。b）铜绿假单胞菌；与对照组相比，*p<0.05。在（a）和（b）中，显示了单个数据点，水平线表示平均值，黄色背景突出显示了没有固定肽的对照组。在非参数Kruskal-Wallis检验中评估统计学显著性，然后在Mann-Whitney检验中进行成对比较。平均值之间存在显著性差异，p<0.05。N=3个单独实验，每个实验中n=3-5个技术重复。

图5.功能化膜的体外细胞毒性。a）细菌纤维素（BC），和b）电纺纤维素：聚氨酯膜（CPU）。将人皮肤成纤维细胞接种在不同肽浓度的功能化膜上，并在1或3天后（d1，d3）评估其细胞代谢活性。箱形图表示第25和75个百分位，须表示最小值和最大值，黑色正方形表示异常值，平均值显示为水平线。在x轴上显示所用膜测得的平均肽浓度。在第1天显示相对于非功能化膜的值（对照组，0，黄色背景）。与d1对照组相比，*p<0.05，与d3对照组相比，＃p<0.05。 N=3个独立实验，其中n=3个技术重复。在非参数Kruskal-Wallis检验中评估统计显著性，然后在Mann-Whitney检验中进行成对比较。

图6.在AMP-CBP-FAM功能化膜上培养的NHDF的CLSM图像。在成像之前将NHDF培养3天。显示了两种不同功能化条件的图像：低肽浓度（在BC或CPU上分别为0.2±0.1或0.3±0.2 µg mL-1）或高肽浓度（在BC或CPU上为1.1±0.4或4.6±1.5 µg mL-1） 。不含任何肽的原始膜用作对照。左行：3×3展开图，显示各个膜的概览；右行：代表点的20倍放大。对NHDF进行肌动蛋白（红色）和细胞核（蓝色）染色。

图7.用CBP-RGD双功能肽对BC膜进行功能化。NHDF在RGD功能化或无肽对照膜上培养a）1天（d1）或b）2天（d2）。与原始BC膜上的NHDF（对照）相比，RGD功能化膜上的NHDF更大且分布更广。c）用alamarBlue评估细胞代谢活性。在第1天将值标准化为BC。与原始膜相比，在RGD功能化的BC膜上观察到细胞的细胞代谢活性增加。d）基于CLSM图像定量细胞扩散面积，并标准化为细胞计数（每个细胞的面积）。与对照组相比，在RGD功能化的膜上，细胞扩散明显更大。N=3个独立实验，其中n=3个技术重复。基于每种条件下的n=8个代表性图像来量化细胞扩散。在非参数Kruskal-Wallis检验中评估统计显著性，然后在Mann-Whitney检验中进行成对比较，*p<0.05。