DOI:10.1021/acsami.9b19452

全球范围内与心血管疾病相关的问题日益增多，这导致了对人造血管移植物的巨大需求。对于小口径人工血管来说，快速内皮化、抑制内膜增生、防止钙化是保持通畅的关键。为了调节血管再生，本文中，研究者开发了一种生物活性的三层组织工程化血管移植物，将microRNA-126和microRNA-145分别包封在纤维内层和中间层。体外细胞活性表明，通过快速释放microRNA-126和缓释microRNA-145，三层电纺膜在增强血管内皮细胞的生长和细胞内一氧化氮生成、调节血管平滑肌细胞（SMCs）的表型以及抑制钙沉积方面具有显著的生物学优势。对大鼠腹主动脉介入模型进行体内植入的组织学和免疫荧光分析表明，双microRNA负载的三层电纺丝移植物对加速内皮化、促进收缩平滑肌细胞再生和促使正常细胞外基质形成具有积极作用。同时，三层血管移植物中microRNA-126和microRNA-145的局部生物活性可能通过促进巨噬细胞向抗炎性M2表型的转化来调节炎症并抑制钙化。这些发现表明，局部递送双重microRNAs的三层电纺移植物可以用作替代人工小口径血管的生物活性替代物。

图1.（A）通过连续三步电纺将miR-126和miR-145分别包埋在纤维内层和中间层的三层血管移植物的示意图。（B）血管移植物中三层的外观、插图和SEM图像。（C）截面移植物和电纺膜表面的SEM图像以及三层移植物每层中的电纺纤维的CLSM图像。负载在电纺纤维中的FAM-NC随机分布在内层和中间层。

图2.（A）三层电纺膜中两种miRNAs的体外释放曲线。（B）释放35天和56天前后三层样品内层的扫描电镜图像。黄色箭头表示断裂或弯曲的纤维。

图3.三层电纺膜局部递送miR-126和miR-145对ECs增殖和NO释放的影响。（A）在不同样品上培养6天后，CD31-免疫荧光染色的ECs的CLSM图像。（B）第3天使用DAF-FM探针在不同样品上培养的ECs中探测细胞内NO释放的荧光图像。（C）EC增殖的CCK-8值。（D）DAF-FM荧光强度的定量显示内皮NO释放。B/B/PCL上培养的ECs中DAF-FM荧光强度为100％。（E）在不同的三层电纺膜上培养的ECs释放到培养基中的NO量。*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001（n=3）。

图4.三层电纺膜局部递送miR-126和miR-145对SMC行为的影响。（A）在不同样品上培养5天后，α-SMA-免疫荧光染色的SMCs的CLSM图像。（B）光学显微镜图像显示第8天茜素红S染色的SMC钙化的抑制作用。（C）SMC增殖的CCK-8值。（D）使用QuantiChrom钙测定试剂盒对SMCs中的钙沉积进行定量，并通过蛋白质浓度标准化。（E）培养5天后通过western印迹测定KLF4、心肌素和MYH蛋白的表达水平，（F）用β-肌动蛋白标准化定量。*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001（n=3）。

图5.体内植入4周后对三层移植物的评估。（A）使用彩色多普勒超声成像系统测试的不同移植物的通畅性，显示出移植物中的血流。箭头指示血流（黄色）和缝合部位（蓝色）。（B）在立体显微镜下植入的移植物的大体视图和（C）腔表面。B/B/PCL移植物内腔中的红色箭头表示肉眼可见的血栓。

图6.植入4周后三层移植物的内皮化。（A）CD31和eNOS标记ECs呈红色。＃移植物管腔位置。（B）用CD31染色对移植物的半纵向部分进行内皮覆盖。细胞核用DAPI（蓝色）复染。绿色箭头表示缝合部位，绿色虚线表示再生的内皮。（C）基于（B）中的CD31染色图像计算的内皮化率。（D）血管移植物腔表面的SEM图像。***p<0.001（n=3）。

图7.植入4周和12周后，不同的三层血管移植物中收缩性SMCs的再生。（A）通过α-SMA抗体和MYH抗体染色检测的SMCs。所有免疫荧光图像均用DAPI（蓝色）对细胞核染色。＃移植物管腔位置。（B）植入4周后，在植入的移植物中，α-SMA阳性和（H）MYH阳性SMCs的百分比。*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001（n=3）。

图8.免疫荧光图像（A，B）和荧光标记的巨噬细胞百分比（C，D，E）显示了植入4周（A）和12周（B）后，miR-126和miR-145对不同的三层移植物中巨噬细胞极化的影响。巨噬细胞百分比是从移植的移植物和天然动脉的横截面图像中获得的，分别用CD68抗体对巨噬细胞(C)、CD206抗体对M2(D)和iNOS抗体对M1(E)进行染色。细胞核用DAPI（蓝色）复染。＃移植物管腔位置。*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001（n=3）。

图9.植入4周后，不同血管移植物中的ECM再生。横截面分别用H＆E、von Kossa、VVG、Masson三色和番红O染色，以鉴定组织形态，外植体中钙化、弹性蛋白、胶原蛋白和糖胺聚糖的存在。＃移植物管腔位置。