DOI: 10.1002/adfm.201910067

华通氏胶（Wharton's jelly，WJ）具有与软骨组织相似的组成和功能，被认为是组织工程气管的潜在支架材料。然而，利用WJ构建工程化新生软骨组织的可行性尚未报道过，更不用说管状气管软骨再生和节段性气管损伤修复了。在此，制备了三种不同脱细胞WJ基质（DWJM）/聚己内酯（PCL）比（8:2、5:5和2:8）的电纺纳米纤维膜。结果表明，随着DWJM含量的增加，软骨的降解速度、吸收和细胞粘附能力有所提高，但力学性能有所减弱，但在体内培养12周后，仅DWJM/PCL（8:2）组能获得满意的均匀软骨再生。此外，利用改进的三明治模型，在二维纳米纤维膜的基础上，利用可控的管腔直径和壁厚构建均匀的三维管状气管状软骨，其中软骨细胞膜结构是绕着硅管滚动的。最重要的是，通过将上述方案与先前建立的血管化和上皮化技术相结合，可以同时实现软骨化、血管化和上皮化，从而在具有与天然气管相似的生物学结构和功能的兔模型上实现了长期（6个月）的气管周向损伤修复，为气管组织工程的临床应用开辟了一条新的途径。

图1.实验设计概述。第一部分，纳米纤维膜的制备。第二部分，纳米纤维膜与软骨细胞结合，用于补片和管状软骨再生。第三部分，用颈阔肌瓣包裹软骨细胞膜，形成新生血管，用于修复兔模型中的节段性气管病变。

图2.WJ的脱细胞。A）天然WJ为白色，含有丰富的GAGs、胶原蛋白和HA，如番红O、天狼星红和阿尔辛蓝染色所示。B）脱细胞后，如HE和DAPI染色所示，核成分几乎完全清除，C）也通过DNA含量分析得到证实。D）羟脯氨酸的定量分析和E）GAG含量表明，脱细胞过程略微降低了WJ中的胶原蛋白和GAG含量。红色箭头代表核成分。缩写：WJ，华尔顿胶；GAGs，糖胺聚糖；HA，透明质酸；HE，苏木精和伊红；DAPI，4'，6-联脒-2-苯基吲哚；BD，脱细胞前；AD，脱细胞后。*p＜0.05。

图3.不同DWJM/PCLWJ/PCL膜的形态、直径分布和力学分析。A）在宏观和SEM观察方面，在不同的DWJM/PCL膜之间未观察到可见的差异。B）直径分布分析表明，所有DWJM/PCL组中的纳米纤维都集中在100和1200 nm之间。C）不同膜的应力-应变曲线有很大差异，膜的杨氏模量随WJ含量的增加而显著降低，断裂应变则呈相反趋势。*p＜0.05。缩写：PCL，聚（ε-己内酯）。

图4.不同DWJM/PCL膜的吸附和降解。A，B）接触角随DWJM含量的减少而显著降低。C）吸水率、E）蛋白质吸收和D）降解速率随DWJM含量的增加而显著增加。*p＜0.05。

图5.DWJM/PCL膜的生物相容性评估。A）SEM和B）生死检查表明，软骨细胞可以很好地在不同膜的表面上扩散，而附着的软骨细胞的数量则随着DWJM含量的增加而呈上升趋势，这通过C）细胞接种效率分析得到了证实。D）软骨细胞在所有组中均表现出良好的增殖能力，并且随着DWJM含量的增加而趋于增加。*p＜0.05。

图6.裸鼠皮下培养6周和12周后，工程化补片的总体视图和组织学检查。所有样本在6-12周内均形成软骨样外观，并变白，这表明样本随着体内培养时间的延长而成熟。A1-A4，D1-D4）W8P2组的样本显示软骨结构相对均一，番红O和II型胶原呈强阳性染色。B1-B4，C1-C4，E1-E4，F1-F4）在W5P5和W2P8组中，样品呈现明显的异质性结构，含有大量非降解支架，只有部分新软骨区域显示II型胶原和番红O染色阳性。黑色箭头表示新软骨区域。蓝色箭头表示剩余支架区域。

图7.裸鼠新生软骨形成的定量评价。C） DNA含量、D）杨氏模量、E）GAGs和F）总胶原含量随PCL含量的增加而显著降低，随植入时间的延长而增加，但A）湿重和B）厚度无统计学显著差异性。*p<0.05。

图8.裸鼠模型中的气管软骨形成。A）将软骨细胞膜（W8P2）构建体包裹在硅管上3次并皮下植入裸鼠中12周后，管状样品形成了软骨样组织。B）横断面和C）纵断面的管状样品的组织学分析显示，软骨结构相对均一，并且对番红O和II型胶原蛋白具有强阳性染色。

图9.在兔模型中新血管形成的管状新气管。A，B）将软骨细胞膜（W8P2）构建体包裹在硅管上3次并肌内植入兔12周后，管状样品形成血管化的软骨样组织。C，C1，C2）管状样品的组织学分析显示出相对均一的软骨结构，对番红O和II型胶原蛋白具有强阳性染色。与天然气管相比，新气管中的所有定量指标，包括D）杨氏模量以及E）DNA、F）GAG和G）总胶原蛋白含量均相似甚至更高。蓝色箭头表示血管组织。黑色箭头表示新软骨。黄色箭头表示肌肉纤维。红色箭头表示包裹的肌肉层的微血管。*p＜0.05。

图10.节段性气管重建的结果。A-C）重建后2、4和6个月时移植物管腔区域的支气管镜图像。气管重建6个月后移植物和天然气管的大体视图。G） 吻合处纵截面的番红O染色。H1，H2）HE和Ⅱ型胶原染色对天然气管软骨和移植气管软骨的影响。J1，J2）HE和CD31的微血管免疫组织化学染色。K1，K2）HE和上皮细胞角蛋白免疫荧光染色。D、F）嫁接区域在黄色箭头之间。J1，J2）红色箭头表示微血管。