既往研究表明，培养在不同弹性模量基材上的细胞能够感受基材硬度的刺激，使细胞内部产生固定的静态牵张力，而这种持续的力在细胞内将激活细胞的信号转导，调控细胞功能。近日，来自苏州大学BCML研究组制备了一种纤维支架，该纤维支架可以同时模拟人体胶原纤维的弹性模量和直径大小，并将其应用于纤维环组织工程再生修复的研究。

随着平板电脑和手机的大量普及，“低头族”越来越多，椎间盘退变已不是老年人的专利，随着组织工程学的发展，应用组织工程技术构建仿生椎间盘逐渐成为研究热点。椎间盘处于一个复杂的力学环境中，生物力学因素在椎间盘退变和再生修复过程中扮演了关键的角色。不仅如此，为了适应承受压缩、剪切等力学刺激，椎间盘的重要组成部分——纤维环的完整性对于保持椎间盘正常的生物力学性质起到至关重要的作用。纤维环是一个非均一的结构，其中直径偏大、硬度较大的Ⅰ型胶原纤维主要分布于纤维环的外区，而直径偏细、硬度较小的Ⅱ型胶原纤维和蛋白聚糖等主要分布于纤维环的内区，因此，针对组织工程纤维环再生修复策略需要同时考虑纤维直径和硬度这两个因素。

Fig. 1 (A) Schematic illustration of normal and degenerative IVDs. (B) Schematic illustration of the anatomic structure of an IVD. (C) 3D representation of an ovine AF using optical coherence tomography. Individual images on the right side show how collagen orientation changes along radial direction. (Reprinted with permissionfrom Han et al., 2015). (D) Forces and motion contribute to axial loading of IVD that is balanced by the hydrostatic pressure generated in the gelatinous NP. Pressure in NP causes tensile stress in the surrounding AF or “hoop stress”(Reprinted with permission from Bowles and Setton, 2017).

 研究者应用“一步法”合成了具有不同弹性模量的聚氨酯材料，并且运用简单的静电纺丝技术制备出软硬度和纤维直径不同的4种纺丝纤维，即小直径，软纤维；小直径，硬纤维；大直径，软纤维；以及大直径，硬纤维（Fig. 2）。该纤维可以同时模拟胶原纤维的直径粗细和硬度大小。进一步，我们将纤维环源干细胞（AFSC）种植在直径和硬度不同的纤维支架上，观察纤维支架对细胞形态的影响，结果发现在大直径的纺丝支架上，细胞铺展较好，呈现类梭形；在小直径的纺丝支架上，细胞皱缩呈类圆形（Fig. 3）。

Fig. 2. The microstructure of scaffolds observed using SEM. SS: soft, small size fibers; FS: stiff, small size fibers; SL: soft, large size fibers; FL: stiff, large size fibers.

Fig. 3 The morphology of AFSCs on scaffolds.

研究者进一步探索支架的软硬和直径粗细对AFSC分化的影响，结果发现支架的软硬和直径对纤维环表型标志基因Col-I, Col-II, Aggrecan, Adamts 17, Sfrp2, Col5a1, Col12a1有显著影响，其中，随着支架硬度和直径大小的增加，纤维环外区表型标志基因Col-I, Adamts 17, Sfrp2, Col5a1, Col12a1表达升高，纤维环内区表型标志基因Col-II和Aggrecan表达降低。该研究结果表明：小直径，软支架可以模拟纤维环内区，而大直径，硬支架可以模拟纤维环外区。纺丝支架的直径大小和软硬程度均对干细胞分化有显著影响，且诱导AFSC分泌与天然纤维环相似微观结构和弹性模量相似区域的细胞外基质分泌（Fig. 4）。

Fig. 4 Expression of AF phenotypic marker genes in AFSCs cultured on PECUU scaffolds after 7 d. Gene expression was normalized to GAPDH expression.

进一步的研究发现，纺丝支架的直径和软硬对AFSC分化的影响主要是通过力学敏感转录因子YAP介导的，随着直径的增大和硬度的增高，YAP的核转录增加（Fig. 5）。在四组直径和软硬程度不同的纺丝支架上加入YAP的抑制剂Verteporfin后，纤维环表型标志基因表达差异性被消除（Fig. 6）。表明YAP在AFSC分化过程中扮演了关键角色。

Fig. 5 YAP nucleus translocation was dependent on stiffness and fiber size of scaffold.

Fig. 6 Mechanical property- and topography-mediated AFSC differentiation was YAP-dependent.

该研究由苏州大学骨科研究所李斌教授课题组完成，于2019年5月9日在线发表于Acta Biomaterialia。

论文信息：

Genglei Chu, Zhangqin Yuan, Caihong Zhu, Pinghui Zhou, Huan Wang, Weidong Zhang, Yan Cai, Xuesong Zhu, Huilin Yang, Bin Li*. Substrate stiffness- and topography-dependent differentiation of annulus fibrosus-derived stem cells is regulated by Yes-associated protein. Acta Biomaterialia 2019, 92:254-264.

论文链接：

https://doi.org/10.1016/j.actbio.2019.05.013