DOI:10.1016/j.biomaterials.2019.119722

肌腱撕裂后的主要问题是修复组织的机械强度低。改善断裂和修复肌腱功能和生物力学性能的一个可行策略是在损伤部位输送生长因子。在此，具有生物活性且可逆扩展的双层乳液和由可生物降解的DegraPol®（DP）（聚酯尿烷）制成的同轴电纺管可作为输送血小板源性生长因子BB（PDGF-BB）的植入物，改善兔跟腱全撕裂模型的肌腱愈合。体外研究表明，乳液和同轴电纺支架均可在30天内持续输送具有类似释放动力学（150-190 pg PDGF-BB/mg DP支架）的生物活性PDGF-BB。三周后的体内评估表明，PDGF-BB通过生物活性DP管的输送使处理过的肌腱的抗张强度提高了2倍，而不会产生额外的促纤维化作用，即伤口处的增生或α-平滑肌肌动蛋白表达增加。尽管±PDGF-BB处理的样品在伤口部位的ECM组成没有观察到显著差异，但与天然肌腱相比，胶原I和III上调而纤连蛋白下调。在远离伤口的区域，定性地观察到胶原蛋白I和III表达较低的区域中纤连蛋白的表达增加。这两种类型的生物活性DP管都提供了对外科医生友好且稳定的植入物，以传递生物活性分子，并在3周后对修复肌腱的强度产生了积极的影响，从而为肌腱修复领域的临床应用提供了有前途的生物活性植入物。

图1.乳液和同轴静电纺丝装置和纤维结构。A和B）用于静电纺丝和同轴静电纺丝的喷丝头的示意图，以及每种设置获得的纤维结构。载PDGF-BB的水相在EE DP纤维中随机分布，而载PDGF-BB的PEG（30 wt%）水溶液则被包裹在CE DP纤维中的DP聚合物壳内的核中。SEM显微照片显示了EE和CE DP支架的形态（俯视图和横截面图）。分别与纯DP支架和/或纯PEG支架相比，EE和CE生物活性和非生物活性DP支架的FTIR吸收光谱。E和F）与纯DP粉末或支架和/或纯PEG支架相比，EE和CE生物活性DP支架的首次加热的DSC热图（非绝对标度）。此外，还比较了支架在用于释放研究之前和30天之后的体外释放研究。比例尺：低倍：20 µm，高倍：10 µm。

图2.PDGF-BB在乳液和同轴电纺生物活性DP支架上的负载和释放。A和E）使用脂肪酶降解DP支架，评价PDGF-BB在乳液和同轴静电纺支架中的有效负载（包封率）。从最低脂肪酶浓度处理的支架中提取的较低的PDGF-BB表明，DP支架的PDGF-BB释放机制是以扩散和降解为基础的。B、C和D）PDGF-BB在EE DP支架上的体外累积释放分别表示为ng mL-1、pg/mg DP或释放的PDGF-BB百分比；F、G和H）PDGF-BB在CE DP支架上的体外累积释放，分别表示为ng mL-1、pg/mg DP或释放的PDGF-BB的百分比。图1B中显示了用于同轴静电纺丝的小喷丝头和大喷丝头的尺寸。

图3.通过评估pAkt水平，乳液和同轴电纺DP支架释放的PDGF-BB的生物活性。A）显示PDGF-BB和PDGFR相互作用以及PDGFR/PI3K/Akt途径中信号转导的示意图，表明PDGF-BB的生物活性和Akt磷酸化相关。B）通过蛋白质印迹分析来分析Akt（pAkt）对剂量依赖性PDGF-BB（0、0.1、0.5、1、10和50 ng mL-1）补充（细胞处理30分钟）的磷酸化状态。密度测量数据表示为平均值±标准偏差；C和D）通过分析Akt（pAkt）的磷酸化状态分别测定了EE和CE DP支架释放的PDGF-BB的生物活性。随时间的推移（第1、2、3、7、14和21天，在含0.1％牛血清蛋白的无血清培养基中进行释放）收集的释放样品在体外对肌腱细胞（细胞处理30分钟）进行测试，并通过蛋白质印迹分析。释放的PDGF-BB对Akt信号通路的激活，导致pAkt的增加，表明生长因子的生物活性随时间而保持。密度测量数据表示为平均值±标准偏差。

图4. 在兔体内模型中，将双层乳液和同轴电纺非生物活性（-PDGF-BB）和生物活性（+PDGF-BB）DegraPol®（DP）管应用于常规修复的（4股缝合线）破裂跟腱的伤口部位。A）插图显示了生物活性（DP）管的设计及其架构。SEM显微照片显示了在植入前用于体内实验的双层EE和CE生物活性DP管的结构。通过乳液或同轴电纺将PDGF-BB掺入DP纤维中来生产生物活性层（B）。将生物活性层电纺在非生物活性（NB）DP层的顶部，该非生物活性（NB）DP层是由纯DP的单次电纺生产的；B）植入DP管后3周提取的肌腱的代表性照片；C）植入后3周的EE和CE DP管的SEM显微照片。在提取的支架中可见降解、纤维形态的损失和裂缝，显示了DP支架在3周内在体内经历的形态变化。比例尺：A）EE图像：100 µm，CE图像：20 µm；C）100 µm。

图5.用乳液和同轴电纺生物活性（+PDGF-BB）或非生物活性（-PDGF-BB）DP管治疗3周后，再生和提取的跟腱的生物力学测试。与未处理（NT）肌腱相比，用生物活性（+PDGF）或非生物活性（-PDGF）DP管处理的再生肌腱的A）横截面积，B）长度[mm]，C）直至破坏的载荷[N]，D）破坏应力[MPa]，E）刚度[N/mm]，以及F）弹性模量[MPa]（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。

图6.植入后3周，细胞对乳液和同轴电纺生物活性和非生物活性DP管响应的定量组织学分析。A和E）与未处理的（NT）肌腱相比，用EE和CE生物活性（+PDGF）或非生物活性（-PDGF）DP管处理的再生肌腱每平方毫米的总细胞密度；B和F）与未处理的肌腱相比，不同处理后再生肌腱中每平方毫米的肌腱细胞和成腱细胞密度；C和G）与未处理肌腱相比，不同处理后再生肌腱中每平方毫米的淋巴细胞密度；D和H）与未处理的腱相比，不同处理后再生的腱中每平方毫米的巨噬细胞密度。将所有结果绘制为平均值±标准偏差（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。

图7.治疗和未治疗肌腱的ki-67和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）染色。与未经治疗的肌腱相比，经过不同处理的再生肌腱的A）胶原纤维取向评分和B）斯托尔评分。得分0代表受损的组织，得分20代表健康的组织。C）使用EE非生物活性（-PDGF-BB）和生物活性（+PDGF-BB）DP管或D）CE非生物活性（-PDGF-BB）和生物活性（+PDGF-BB）DP管治疗的肌腱或E）天然（NT）未经处理的肌腱，ki-67（阳性细胞染色为棕色）和α-SMA（绿色信号）染色的代表性图像。箭头：Ki-67阳性增殖细胞的例子。F）使用QuPath针对经治疗的肌腱中的每种情况分析的每个视野（FOV）中的ki-67阳性细胞百分比。天然肌腱中不存在增殖细胞，因此未对其进行任何分析。E）通过将总α-SMA染色信号的面积分析归一化为每个FOV中的细胞总数来确定每个视野的每个细胞α-SMA面积（FOV）。使用Bonferroni事后检验，将数据与单向方差分析进行比较。误差条代表标准偏差。n.s.表示无显著性。比例尺：50 µm。（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。

图8.植入后3周，经处理和未经处理的肌腱中的胶原蛋白I、胶原蛋白III和纤连蛋白染色。A）天然肌腱组织中胶原蛋白I、胶原蛋白III和纤连蛋白表达的代表性图像。B）用非生物活性（-PDGF-BB）和生物活性（+PDGF-BB）乳液和同轴电纺管处理的肌腱的代表性图像显示伤口部位内的胶原蛋白I、III和纤连蛋白表达。C）用非生物活性和生物活性同轴电纺管处理过的肌腱的代表性图像显示胶原蛋白I、III和纤连蛋白在远离伤口部位的肌腱组织中表达。使用DAB生色检测系统对I型和III型胶原蛋白染色，而对于纤连蛋白检测则进行免疫荧光检测。比例尺：50µm。